焦磷酸测序

焦磷酸测序:
DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。

在基于Sanger
法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。

Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。

在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。

新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。

Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．
一、Pyrosequencing技术的原理
首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。

PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。

Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。

反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。

反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。

测序反应是这样进行的：在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如该dNTP与模扳配对，聚合酶就可以催化该dNTP 掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。

掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。

硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。

ATP 驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。

光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。

每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

然后就可以
加入下一种dNTP。

过程见图1 Pyrosequencing技术的原理：随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。

商品化的Pyrosequncing试剂盒通过以下几点来保证反应的有效进行:底物浓度已最佳化，高质量的三磷酸腺苷双磷酸酶保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPαS；dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入；ATP 合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目。

有必要指出的是yrosequencing技术可以确定一个模板的20-30bp的序列。

有的研究者经过改进而使该技术的读序长度增加一倍以上[1]。

为了增加信噪比，在Pyrosequencing技术中，用dATPαS取代dATP，因为dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效利用，也更有利于阅读富含T的区域，且dATPαS不是荧光素酶的底物。

但dATPαS是两种异构体SpdATPαS和RpdATPαS的混合物，聚合酶只能利用SpdATPαS。

因此，为了得到最佳反应效率，必需使反应体系中保持最佳浓度的SpdATPαS，但同时增加了相应浓度的无用的RpdATPαS。

dATPαS被双磷酸酶降解后的产物是双磷酸酶的抑制剂，所以随着反应进行，被双磷酸酶降解的dATPαS的降解产物浓度越来越大，双磷酸酶的活性越来越低。

这可能是Pyrosequencing技术测序长度很短
（20-30bp）的主要原因之一。

新的革新就在于在反应体系中只加入SpdATPαS，这样一来可以大大降低dATPαS降解产物的浓度，维持双磷酸酶较长时间的活性。

目前这个革新可以使Pyrosequencing技术的测序长度增加最少一倍，达到50至上百bp。

二，Pyrosequencing技术在DNA测序和SNP研究中的应用: Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技术，因此该技术的第一个应用是DNA序列分析，基于该技术的分析系统配合相应软件还可以进行基于DNA序列分析的已知SNP的分析和SNP频率确定。

Pyrosequencing技术对DNA片段的序列分析的读序长度有限，但这并不影响其在生命科学研究中的价值.我们知道，在很多场合中，我们对DNA序列分析的要求是读序越长越好，比如诸如人类基因组计划的工作，而在很多场合中，读序长度并不是主要指标，读序精确和能说明问题是主要指标，比如分子临床诊断领域，对细菌和其他病原微生物的分子诊断，只需对最能代表该微生物的DNA片段进行分析即可，最能代表该微生物的DNA片段往往也就十几到几十bp。

可以提供序列资料的分子诊断是分子诊断的黄金标准，其权威性比其他DNA分析方法如NORTHERN，基因芯片和定量RT-PCR技术更好。

SNP研究大致分为两个部分，一是SNP数据库的建立，二是SNP功能的研究。

一种生物的所有SNP的数据库的建立是一件很大的工程，可以承担该工作的是那些具有大规模基因组测序能力的研究单位，而且数据库的建立很大程度上依赖Sanger法测序。

但众所周知，如果不研究每个SNP的功能，数据库的建立即SNP的发现就没有多大意义。

对已发现的SNP的功能的研究，有两个工作是必须的，一是SNP频率分析，一是SNP位点的碱基种类的证实.对于前者，Pyrosequencing是这样进行的:假设研究者手中有若干份来自不同个体的基因组DNA样品，要测这些不同样品的同一SNP的频率，那么研究者可以混合这些样本的基因组DNA，然后做一次PCR，进行一次测序，研究者就可以得到该SNP在这些样本中的频率.如果研究者已经有了各个样本的PCR产物，也可以将PCR产物混合后进行一次PYRO，就可以知道该SNP频率.已有的文献已经做过高达1126样本的PCR产物的混合来确定SNP的频率[2]。

这种做法极大地减少了研究者的实验次数和实验消耗。

一些其他研究也利用Pyrosequencing 技术来确定SNP频率[3，4]。

如果是SNP位点的碱基种类的证实，需要首先得到特定SNP所在DNA片段，即PCR产物，然后在SNP位点的上游和/或下游设计测序引物，这样通过对十几个bp序列测定来确定SNP位点的碱基种类及SNP位点上下游十几个碱基的序列.诸如四倍体马铃薯的一些SNP分析[5]和用于法医研究的线粒体DNA SNP分析[6]也是利用Pyrosequencing技术进行的。

注：转自生物通--黄文晋博士
最早开发出这一技术并将该技术商业化的是biotage 公司我们现在采用的就
是他们的仪器，给大家介绍一下它的有点（我可不是要卖这个仪器啊）
焦磷酸测序测序仪
系统用途：
多用途遗传分析系统，可应用于各种遗传多态性标记的分析检测，如SNP、突变、插入/缺失、甲基化、基因拷贝数等；等位频率分析；此外，还可应用于各种微生物的鉴定、分型、耐药性评估，并可对多种亚型或野生株及突变株、耐药株组成的复杂群体中的各个组分含量直接加以定量评估；
1.工作环境
1.1 环境温度：18- 28 °C
1.2 相对湿度：30 %-90 %
1.3 适用电源：220V，50Hz，最大功率280W
2.技术指标
2.1 系统功能指标
2.1.1 多用途：可进行SNP分析，突变检测，缺失和插入分析，CpG岛甲基化分析,细菌、病毒鉴定和分型，耐药性分析等，并且有多篇高水平论文支持。

2.1.2 * 采用DNA测序的原理来进行SNP分析，在得到SNP基因型的同时，还可得到多态性位点上下游的序列信息作为参照。

2.1.3 * 通过实时测序的原理得到DNA序列信息，不需要任何电泳或荧光标记。

2.1.4多重分析功能：可以将三个不同的SNP位点放入一个样品孔中进行检测，降低实验成本，进一步提高通量。

2.1.5 *只需一次反应，就可以给出分析2、3和4等位基因SNP的分析结果。

2.1.6 * 等位基因频率分析：可以使用Pooling策略，在一次反应中混合成百，甚至上千份DNA样本，进行等位基因频率分析，加快实验进程，降低成本，频率分析可检出低至5％的频率。

2.1.7 * 检测速度：十分钟左右完成96个样本SNP分析。

2.1.8 通量灵活，易于调节：每次可以选择运行1－96个样本，每个样本可进行不同的SNP位点分析。

2.1.9准确性和重复性：准确性99.95％以上，重复性几乎为100％。

附带上面文章的一章图片。