焦磷酸测序
焦磷酸测序反应
(Cat. No 970922 for CpG and long sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (1200µl) dGTP, dCTP, dTTP (660µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer* PyroMark Q24 Binding Buffer**
室温1400RPM振 摇5~10min
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
设计dNTP分配顺序： 点击工具栏 New Assay图标；文件夹右 键>New Assay；File> New Assay; AQ Assay: 等位基因 SNP Assay:核苷酸多态性 CpG Assay：甲基化 SEQ Assay：未知序列测序
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
AQ/SNP Assay设计：
Sequence to Analyze; Generate Dispensation Order; Dispensation Order
SEQ Assay 设计：
直接在Dispensation Order 输入
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
焦磷酸测序技术的流程
焦磷酸测序技术的流程英文回答：Sequencing technologies have revolutionized the fieldof genomics, allowing us to unravel the genetic code of organisms. One of the widely used sequencing techniques is the Sanger sequencing method, also known as the chain termination method or dideoxy sequencing. This technique relies on the incorporation of chain-terminating dideoxynucleotides (ddNTPs) during DNA synthesis.The process of Sanger sequencing involves several steps. First, the DNA sample of interest is isolated and purified. This can be done from various sources, such as blood, tissue, or cultured cells. Once the DNA is extracted, it is fragmented into smaller pieces to facilitate the sequencing process.Next, the DNA fragments are amplified using the polymerase chain reaction (PCR). PCR is a technique thatallows for the amplification of specific DNA sequences. It involves multiple cycles of DNA denaturation, primer annealing, and DNA synthesis. During PCR, primers specific to the target DNA sequence are used to initiate DNA synthesis.After PCR amplification, the sequencing reaction is set up. This involves mixing the amplified DNA fragments with a primer, DNA polymerase, and a mixture of normal deoxynucleotides (dNTPs) and small amounts of chain-terminating ddNTPs. The ddNTPs lack the 3'-OH group necessary for DNA chain elongation, resulting in the termination of DNA synthesis at specific positions.The sequencing reaction mixture is then subjected to capillary electrophoresis. In this step, the DNA fragments are separated based on their size and charge as they migrate through a gel-filled capillary under the influence of an electric field. The fragments are detected by a fluorescent dye attached to the ddNTPs, which emits a signal when excited by a laser.The data obtained from the capillary electrophoresisare processed and analyzed using specialized software. The software assigns a nucleotide base to each peak in the electropherogram, which represents the sequence of the DNA fragment. The sequence is determined by analyzing the order of the peaks corresponding to the different nucleotides.Once the sequence is obtained, it can be compared to known reference sequences or analyzed further for various purposes, such as identifying genetic variations orstudying gene expression patterns.中文回答：焦磷酸测序技术（Sanger测序）已经彻底改变了基因组学领域，使我们能够解读生物体的遗传密码。
焦磷酸测序
2、复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
3、延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的 四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合 酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新 的DNA链。
4、 循环特点：
① 上一链的只两 条（无引物存于两个子代DNA分 子中 ） ，其它子代DNA分子都为 双引物分子 ③ 处于两引物之间的DNA序列呈 指数增长1×2N
• 在80-100℃的温度范围内，DNA的 双螺旋结构将解体，双链分开，这个 过程称为变性；当温度缓慢降低后， 两条彼此分离的DNA链又会重新结合 成双链，这个过程称为复性。
三、复制方向（5’~3’）
1、DNA分子的3’端与5’端：-OH端 为3’; 磷酸基团的末端为5’ 。 2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核 苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键 连接而成。
焦磷酸测序
峰形图
➢ 峰高与结合模板的dNTP数量成正比 ➢ 原始数据会被软件自动转化为序列信息
✓ 高温变性 ✓ 低温退火 ✓ 适温延伸
具有特异性强、灵敏度高、操 作简便、省时等特点
一、PCR反应的条件
1、一定的缓冲溶液； 2、DNA模板； 3、分别与两条模板链相结合的两种引物； 4、四种脱氧核苷酸：4种dNTP混合物； 5、耐热的DNA聚合酶； 6、控制温度（PCR重要条件）。
二、DNA变性和复性
基因测序
➢ 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测 定，也就是测定组成DNA分子的A、 T、G、C的排列顺序。
A-T-T-C-A-C-G-G-T-AC
焦磷酸测序步骤
一 PCR 二 焦磷酸测序
PCR
➢ 聚合酶链式反应 ➢ 亦称之为DNA扩增，是 DNA复制的体外模拟
焦磷酸测序法原理
焦磷酸测序法原理
焦磷酸测序法原理是一种用于DNA序列测定的方法，也被称为焦磷酸法。
该方法是一种常用的测序技术，具有高效、高精度和高通量的特点，被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断和药物研发等领域。
焦磷酸测序法的原理是利用DNA聚合酶在DNA合成过程中选择性地将2',3'-二氟脱氧核苷酸三磷酸酯（ddNTPs）引入合成链中，从而使合成过程中断，形成一系列不同长度的DNA片段。
这些DNA片段经过电泳分离后，根据片段长度的顺序可以确定DNA的序列。
在焦磷酸测序法中，DNA样本首先通过PCR扩增得到模板DNA，然后将DNA模板与引物、DNA聚合酶和四种dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸酯）一起放入PCR反应管中进行DNA合成。
在DNA合成的过程中，添加的每一种ddNTPs
（2',3'-二氟脱氧核苷酸三磷酸酯）会随机地终止DNA链的延伸，从而在不同的位置引入标记。
最后，通过电泳分离不同长度的DNA片段，根据不同的标记位置确定DNA的序列。
焦磷酸测序法的原理基于DNA合成的特性和ddNTPs的选择性终止作用，通过测定DNA片段的长度和标记位置来确定DNA的序列。
这种测序方法的优势在于高通量、高灵敏度和高准确性，能够快速、准确地测定DNA的序列，为基因组学研究和生物医学领域的研究提供了重要的技术支持。
焦磷酸测序法的原理和方法的不断改进和发展，使其在DNA测序领域中具有重要的应用前景。
焦磷酸测序实验步骤
焦磷酸测序实验步骤Control oligo稀释配置，需要二次稀释到0.04um：第一次稀释：体积浓度Control oligo 5ul 20um1×Dilution buffer 45ul第一次所得溶液50ul 2um第二次稀释：第一次所得溶液3ul 2um1×Dilution buffer 147ul第二次所得溶液 150ul 0.04um1.微珠固定PCR产物将生物素标记的PCR 产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠（Streptavidin Sepharose High Performance，GE Healthcare）上。
1.1 轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液。
1.2 在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量（2 μl / 样品）（新的琼脂糖微珠浓度比原来的提高了一倍，只需加1ul）与结合缓冲液（40 μl / 样品）。
添加高纯度水至80 μl / 孔的总体积—包括第1.4 步中添加的PCR产物，纯水量取决于所用PCR 产物的量。
例如：如果使用15 μl PCR 产物、2 μl 微珠和40 μl 结合缓冲液，则必须添加23 μl 高纯度水。
1.3 将第1.2 步中制备的溶液添加至24 孔PCR 孔板或联排管中。
1.4 根据孔板设置，添加5–20 μl 优化好的生物素标记的PCR 产物至PCR 孔板（或联排管）的每个孔槽。
（注意：每个孔槽的总体积应当是80 μl。
）1.5 使用孔板条盖密封PCR 孔板（或联排管）。
确保孔槽之间没有泄漏。
1.6 使用振荡混合器（1400 rpm）不断振荡PCR 孔板（或联排管）至少5–10 分钟。
（注意：微珠沉淀快速，因此停止震荡后必须在一分钟内立即使用，即立刻捕获琼脂糖微珠。
）2. 真空工作站准备工作2.1 准备以下试剂：（1）大约50ml乙醇（70%）；（2）大约40ml变性溶液；（3）大约50ml 1×洗涤缓冲液；（4）大约50ml超纯水；（5）大约70ml超纯水。
焦磷酸测序原理
焦磷酸测序原理焦磷酸测序是一种常用的测序技术，通过测序仪器对DNA序列进行快速而准确的测定。
它是一种基于合成DNA链延伸的原理，可以在短时间内测定DNA序列。
焦磷酸测序的原理是利用DNA合成过程中的焦磷酸（dideoxynucleotide）来终止链延伸的反应。
焦磷酸是一种具有缺少3'-羟基的核苷酸，它会被DNA多聚酶插入到正在合成的DNA链中，但一旦焦磷酸被插入，DNA链延伸就会停止。
这样，每次加入一个不同的焦磷酸，就可以得到具有不同长度的DNA片段。
焦磷酸测序的步骤如下：1. DNA模板制备：首先，需要从待测DNA样本中提取出目标DNA片段。
这可以通过PCR（聚合酶链反应）或其他方法来进行。
然后，将目标DNA片段加入到一个含有多聚酶和引物的反应混合物中。
2. DNA合成：在反应混合物中，加入四种不同的焦磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），以及四种普通的核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。
这样，当DNA链延伸到某个位置时，如果接下来要插入的是焦磷酸，链延伸就会终止。
3. 前序列扩增：在DNA合成过程中，每次加入的焦磷酸是不同的，因此会得到不同长度的DNA片段。
然后，将反应混合物分离成不同长度的DNA片段。
4. DNA片段分离：将反应混合物中的DNA片段进行电泳分离，根据片段大小的不同，可以得到一个DNA片段长度的分布图。
5. 数据分析：通过测序仪器对DNA片段进行测定，得到每个片段的长度信息。
根据这些信息，可以推导出DNA序列。
焦磷酸测序的优点是速度快、准确性高、适用于多种类型的样品。
它被广泛应用于基因组学、遗传学、生物医学研究等领域。
然而，焦磷酸测序也存在一些限制，例如不能测定长片段的DNA，且在测序过程中容易产生误差。
焦磷酸测序是一种基于合成DNA链延伸的原理，通过插入焦磷酸来终止链延伸的反应，从而快速而准确地测定DNA序列。
它在基因组学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为我们深入了解DNA序列提供了有效的工具。
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
简述焦磷酸测序技术的流程
简述焦磷酸测序技术的流程英文回答：The process of pyrophosphate sequencing, also known as pyrosequencing or 454 sequencing, involves several steps.It is a high-throughput DNA sequencing method that utilizes the detection of pyrophosphate released during DNA synthesis. Here is a brief overview of the pyrophosphate sequencing workflow:1. DNA Sample Preparation: The first step is to extract the DNA from the sample of interest. This can be done using various methods depending on the source of DNA. For example, if the DNA is from a blood sample, it can be extractedusing a commercial DNA extraction kit.2. DNA Fragmentation: The extracted DNA is then fragmented into smaller pieces. This can be achievedthrough mechanical shearing, enzymatic digestion, or sonication. The purpose of fragmentation is to obtainshorter DNA fragments that can be sequenced more easily.3. Adapter Ligation: Short DNA sequences called adapters are ligated to the fragmented DNA. Adapters contain specific sequences that allow for attachment to the sequencing platform and facilitate the amplification of DNA fragments.4. Emulsion PCR: The adapter-ligated DNA fragments are then amplified using emulsion polymerase chain reaction (PCR). This process involves the encapsulation ofindividual DNA fragments in water-in-oil emulsion droplets, each containing a single DNA fragment and the necessary reagents for PCR amplification.5. DNA Sequencing: The emulsion PCR droplets containing the amplified DNA fragments are then transferred to a sequencing plate or flow cell. The DNA fragments are immobilized on a solid support and subjected to DNA synthesis. During DNA synthesis, the addition of each nucleotide triggers the release of pyrophosphate if it is incorporated into the growing DNA chain.6. Pyrophosphate Detection: The released pyrophosphate molecules are converted into visible light signals through a series of enzymatic reactions. These light signals are captured by a detector and recorded as a sequence of peaks, representing the order of nucleotides incorporated during DNA synthesis.7. Data Analysis: The recorded sequence of peaks is then analyzed using bioinformatics tools and software. The sequence data is aligned to a reference genome or assembled de novo to generate a consensus sequence.8. Result Interpretation: The final step involves interpreting the sequence data to identify genetic variations, mutations, or other relevant information. This can be done by comparing the obtained sequence with known reference sequences or by searching for specific genetic markers.中文回答：焦磷酸测序技术的流程包括以下几个步骤。
基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]
![基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]](https://img.taocdn.com/s3/m/6f61366fb84ae45c3b358c72.png)
a/g C T G C C T A/G Heterozygote Single height ref peaks 单个高度的参考峰 Double height ref peak两倍高 度的参考峰
Genotype:基因型 2 half height peaks 两个半高峰
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only
- 15 -
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序流程
实验设计 测序 PCR 试样预处理， 获得单链模板
结果分析
1-2h /96 sample
SNP: 10min/96 sample SQA:35 min/96 sample 15 min/96 sample
Homozygous G 纯合子G
GCTGCCT --------CGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A
G
C
T
A
G
Heterozygous A/G 杂合子A/G
ACTGCCT --------TGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A G C T A G
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only -6-
Reference Peaks参考峰
Sample & Assay Technologies
Pyro技术原理
Pyrogram™ 的产生
焦磷酸测序原理
焦磷酸测序原理引言:随着生物学研究的深入，基因测序技术得到了广泛应用。
而焦磷酸测序作为一种常见的测序方法，具有高通量、高精度和高效率的特点，被广泛应用于基因组学、遗传学和生物医学研究领域。
本文将介绍焦磷酸测序的原理及其应用。
一、焦磷酸测序原理概述焦磷酸测序（pyrosequencing）是一种基于酶反应的测序技术，通过检测DNA链合成过程中的焦磷酸释放，实现对DNA序列的测定。
其原理可概括为以下四个步骤：DNA样本制备、PCR扩增、焦磷酸测序反应和数据分析。
二、DNA样本制备焦磷酸测序需要从样本中提取目标DNA，并进行纯化和定量。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿提取法、离心柱法等。
提取得到的DNA需要进行纯化，去除杂质。
纯化后的DNA样本需要定量，以确保测序反应的准确性和可靠性。
三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种体外合成DNA的技术，在焦磷酸测序中起到扩增DNA片段的作用。
通过PCR反应，可以将目标DNA片段快速扩增至足够数量进行测序。
PCR扩增需要合适的引物，引物的选择要根据待测序列的特点进行设计，以确保扩增效率和特异性。
四、焦磷酸测序反应焦磷酸测序反应是焦磷酸测序的核心步骤。
在反应中，通过在DNA 合成过程中的每个碱基加入一种特殊的酶和核苷酸，使其发生焦磷酸释放的反应。
这种酶反应会引起光信号的释放，并被荧光探测器所检测。
不同的碱基在加入后会产生特定的光信号，通过检测这些光信号的顺序，可以确定DNA序列。
五、数据分析在焦磷酸测序中，荧光强度与焦磷酸释放的数量成正比，通过分析测序反应过程中的荧光信号，可以获得DNA的碱基序列。
数据分析是整个焦磷酸测序过程中非常重要的一步，需要对荧光信号进行处理和解读。
通常使用专门的测序分析软件进行数据处理，根据荧光信号的峰值和强度，确定DNA序列。
六、焦磷酸测序的应用焦磷酸测序技术具有高通量、高精度和高效率的特点，广泛应用于基因组学、遗传学和生物医学研究领域。
焦磷酸测序操作流程
焦磷酸测序操作流程一、准备工作。
焦磷酸测序听起来就很厉害的样子呢，但其实只要我们做好准备工作，就没有那么难啦。
我们得先把实验室的环境准备好哦。
要确保实验室干净整洁，各种仪器摆放整齐，这样我们在操作的时候心情也会好很多呢。
然后就是仪器的检查啦。
就像我们出门前要检查钥匙有没有带一样，要看看测序仪是不是能正常工作。
检查它的电源连接是否稳固，各个部件有没有松动或者损坏的迹象。
要是仪器出问题了，那可就像做饭的时候炉灶坏了一样，啥都干不成啦。
试剂也是很重要的一部分哦。
焦磷酸测序需要用到很多种试剂呢，我们要把它们都找齐。
这些试剂就像做菜的调料一样，少了哪一种都不行。
要检查试剂的保质期，要是用了过期的试剂，那结果可就没准儿啦。
就像过期的牛奶喝了会拉肚子一样，过期的试剂肯定会让测序结果出岔子的。
二、样本准备。
样本可是我们测序的主角呢。
我们要小心翼翼地对待它们。
首先要采集到合适的样本，这个过程就像寻宝一样，要找对地方，用对方法。
如果是生物样本的话，要确保采集的样本具有代表性。
比如说从组织中采集样本，可不能只采到病变边缘或者完全正常的地方，得采到能反映真实情况的部分。
采集好样本之后，就要对样本进行处理啦。
这个处理过程就像是给样本做个“美容”，让它能更好地适应测序的过程。
可能需要提取DNA或者RNA之类的，这个过程要按照标准的操作规程来做。
要是手法太粗糙，就像给头发做造型的时候用力过猛，把头发扯断了一样，样本也可能被破坏掉呢。
处理好的样本要进行定量和质检。
这一步就像是给样本量身高称体重一样，看看它符不符合测序的要求。
如果样本的量太少或者质量不好，就像一个身体虚弱的运动员参加比赛，很难有好的表现的，测序结果可能就不准确啦。
三、测序反应。
把混合好的东西放到测序仪里面，就像把宝贝放进保险箱一样。
然后启动测序仪，这个时候就只能耐心等待啦。
测序仪在工作的时候，就像一个勤劳的小蜜蜂，在那里忙忙碌碌地进行着各种复杂的操作。
我们可不能去打扰它哦，不然它可能就会出错啦。
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
焦磷酸测序步骤中文版
焦磷酸测序步骤一、实验操作（一）甲基化检测亚硫酸氢盐转化1． bisulfite Mix+800μL Rnase free water，窝旋5min/60℃加热窝旋混匀（配置好的bisulfite Mix勿放置冰上）2. 配置buffer反应液，室温混匀：DNA Solution （1μg）+RNAfree water 共20μl+bisulfite Mix 85μl+DNA protect buffer 5μl，（配置好的体系为140μl，不方便上PCR仪，最好分为两管70μl）3. 上PCR仪，95℃5min→60℃25min→95℃5min→60℃85min→95℃5min→60℃175min→20℃20min，热循环结束，将PCR product转入Spin-column，加入560 Buffer BL。
（当DNA微量时，需要加入carrier RNA，其加强DNA与column膜的结合；当DNA 量>100ng，则不需要加入carrier RNA）混匀，12，000rpm，1min，废弃液。
4. 清洗Bisulfite DNA convertion1）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
2）加入500μl buffer BD，室温放置15min（加入buffer BD快速盖盖子，避免出现白色沉淀）3）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
4）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
5） 12,000rpm，1min，废弃液。
6） 56℃5min（蒸发残余液体）7） 20μl Buffer EB溶解，12,000rpm，1min（-20℃，可保存3年）PCR扩增目的片段回收的PCR product 1：5稀释→取2μl→PCR→准备焦磷酸测序焦磷酸测序1．在PCR板中，准备微珠预混液配制（每管）1）Beads：3μl，Binding Buffer，40μl，模版：20μl，dd Water：补足80μl。
焦磷酸测序技术
焦磷酸测序技术一、简介焦磷酸（Fluorophosphate）序列测序技术是一种以焦磷酸为序列标记物的DNA测序技术，采用的是大肠杆菌焦磷酸脱氧核酸病毒（T7 DNA polymerase）以及催化的酶促反应。
它是通过双向DNA测序的方法来检测DNA序列，它能够精确地检测每个底片包含的每一个核苷酸的序列，焦磷酸序列测序技术与其他常用的序列测序技术相比，具有可靠性高、分辨率高、序列片段速度快、数据准确性高等优点，因此被广泛应用于生物学、分子生物学和基因组学研究中。
二、原理焦磷酸序列测序技术是一种以单碱基计数（single-base counting）为基础的DNA测序技术，它是一种双向测序（bidirectional sequencing）技术。
焦磷酸测序技术的运行原理是：采用大肠杆菌焦磷酸脱氧核酸病毒（T7 DNA Polymerase），也称为DNA Polymerase I，它是一种酶激活的反应，通过无序采样来合成DNA片段，然后将被标记的焦磷酸（Fluorophosphate）注入DNA测序系统中，当它们反应时，它会对这些片段各个位置的核苷酸（nucleotides）进行标记，通过荧光检测器检测荧光结果，从而得到DNA序列。
三、应用1、病毒分类：焦磷酸序列测序技术可用于病毒的分类和鉴定，根据病毒DNA的焦磷酸序列来确定该病毒的属、种、亚种和株类。
2、研究特定基因：焦磷酸序列测序技术可以用于特定基因的研究，如基因组学研究、表达调控分析等，旨在了解基因的功能。
3、检测突变：焦磷酸序列测序技术也可以用于检测突变，可以检测多态性和突变，这些信息可以用于药理学研究、疾病诊断和基因治疗。
4、检测病毒：焦磷酸序列测序技术可以用于检测病毒，如HIV病毒，可以用来研究病毒的进化变异，从而更好地控制和预防病毒所引发的疾病。
焦磷酸测序
罗氏454测序系统中文名罗氏454测序系统测试原理基于焦磷酸测序法特点依靠生物发光对DNA序列进行检测测序流程支持各种不同来源的样品序列测定测试原理GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。
在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
测序流程1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。
短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。
3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。
接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。
图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。
5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。
经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。
6. 数据读取和分析工具：GS FLX系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
焦磷酸测序
Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。
第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。
第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。
注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。
第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。
ATP sulfurylasePPi+APS —————————> ATPLuciferase，ATPLuciferin —————————> oxyluciferin光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。
每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
第五步——然后加入下一种dNTP。
在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。
利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。
焦磷酸测序反应
❖ 二，Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 ❖ 三，仪器维护
焦磷酸测序简介
基于合成的测序（边合成边测序），对DNA 序列进行精确分析和定量分析。
焦磷酸测序反应 体系中有4 种酶
DNA-Polymerase（DNA聚合酶） ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶） Luciferase（荧光素酶） Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶） 每次只加一种dNTP（A，T，C，G）
C
A
G
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
C
T
G
CT
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T 基因型为 A/G的杂合子
2个半倍峰高的峰
1倍峰高的参考峰
2倍峰高的参考峰
C
A
G
T
阴性对照
C
T
G
C vs 焦磷酸测序
传统的测序 整基因组测序 研究未知基因 对DNA大片段测序
*Ronaghi, M., Uhlén, M., Nyrén, P. (1998) Real-time pyrophosphate detection for DNA sequencing. Science 281:363.
e7-3焦磷酸测序与深度测序
e7-3 焦磷酸测序与深度测序1. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其参入到引物链的3′-端，并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。
PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。
每个峰值的高度与反应中参入的核苷酸数目成正比。
第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。
整个测序反应分为四步[图e7-3(1)]：图e7-3(1) 焦磷酸测序的原理（1）将单链DNA模板与其特异性的测序引物结合，然后加入四种酶的混合物，包括：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（A TP sulfurylase，APS）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）。
反应底物有腺苷-5′-磷酸硫酸（adenosine-5′-phosphosulfate，APS)和荧光素（luciferin）。
（2）向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好能和DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA 聚合酶的作用下，被添加到测序引物的3′-端，同时释放出1分子的PPi。
dA TP 由腺苷-α硫-三磷酸（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate，dATPαS）替代，原因是DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dA TP的催化效率高，且dATPαS不是荧光素酶的底物。
（3）在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合，形成氧化荧光素，同时产生可见光。
通过电荷耦合器（charge coupled device，CCD）光学系统，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量A TP在双磷酸酶的作用下发生降解。
（5）加入另一种dNTP，按第2、3、4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
焦磷酸测序技术的原理
在同一焦磷酸测序反应体系中，产生的荧光信号强度与ATP的量成正比，而ATP的量与聚合的dNTP个数成正比，所以可以根据图谱中测得的信号强度推测出模板DNA相对含量。为了验证焦磷酸测序的定量特性，人为设计了一条测序单链(5′ GG TT CC AA G T C A CCCCGCCCGC 3′ )和一条测序引物(5′ GCGGGCGGGG 3′)，使测序单链的3′端与测序引物单链的5′端完全互补。两条单链退火后按dTTP→dGTP→dATPαS→dCTP的顺序循环递加dNTP进行测序反应。结果显示，待测模板上测序引物的延伸序列为“T G A C TT GG AA CC”12个碱基，其信号强度跟同质区的相同碱基个数成正比。这一结果表明，峰强度与被引物延伸模板的量成正比，可通过测定各峰的峰高之比确定对应的模板的相对含量。本研究利用焦磷酸测序技术的定量特性，通过测序图谱中的峰高比值分析不同来源的基因相对表达量。
3结果与讨论
3.1方法原理
焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技术。其原理是：引物与模板DNA退火后,在DNA聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP与模板互补时，DNA模板与互补的dNTP聚合可以产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi与5′磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生成等量的ATP;在荧光素酶催化作用下，ATP与虫荧光素(luciferin)反应发出荧光。产生的荧光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，根据加入的dNTP类型和测得的荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。反应方程式如下：
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焦磷酸测序:
DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger
法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．
一、Pyrosequencing技术的原理
首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
测序反应是这样进行的：在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如该dNTP与模扳配对，聚合酶就可以催化该dNTP 掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。
掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。
ATP 驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。
光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。
每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
然后就可以
加入下一种dNTP。
过程见图1 Pyrosequencing技术的原理：随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。
商品化的Pyrosequncing试剂盒通过以下几点来保证反应的有效进行:底物浓度已最佳化，高质量的三磷酸腺苷双磷酸酶保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPαS；dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入；ATP 合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目。
有必要指出的是yrosequencing技术可以确定一个模板的20-30bp的序列。
有的研究者经过改进而使该技术的读序长度增加一倍以上[1]。
为了增加信噪比，在Pyrosequencing技术中，用dATPαS取代dATP，因为dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效利用，也更有利于阅读富含T的区域，且dATPαS不是荧光素酶的底物。
但dATPαS是两种异构体SpdATPαS和RpdATPαS的混合物，聚合酶只能利用SpdATPαS。
因此，为了得到最佳反应效率，必需使反应体系中保持最佳浓度的SpdATPαS，但同时增加了相应浓度的无用的RpdATPαS。
dATPαS被双磷酸酶降解后的产物是双磷酸酶的抑制剂，所以随着反应进行，被双磷酸酶降解的dATPαS的降解产物浓度越来越大，双磷酸酶的活性越来越低。
这可能是Pyrosequencing技术测序长度很短
（20-30bp）的主要原因之一。
新的革新就在于在反应体系中只加入SpdATPαS，这样一来可以大大降低dATPαS降解产物的浓度，维持双磷酸酶较长时间的活性。
目前这个革新可以使Pyrosequencing技术的测序长度增加最少一倍，达到50至上百bp。
二，Pyrosequencing技术在DNA测序和SNP研究中的应用: Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技术，因此该技术的第一个应用是DNA序列分析，基于该技术的分析系统配合相应软件还可以进行基于DNA序列分析的已知SNP的分析和SNP频率确定。
Pyrosequencing技术对DNA片段的序列分析的读序长度有限，但这并不影响其在生命科学研究中的价值.我们知道，在很多场合中，我们对DNA序列分析的要求是读序越长越好，比如诸如人类基因组计划的工作，而在很多场合中，读序长度并不是主要指标，读序精确和能说明问题是主要指标，比如分子临床诊断领域，对细菌和其他病原微生物的分子诊断，只需对最能代表该微生物的DNA片段进行分析即可，最能代表该微生物的DNA片段往往也就十几到几十bp。
可以提供序列资料的分子诊断是分子诊断的黄金标准，其权威性比其他DNA分析方法如NORTHERN，基因芯片和定量RT-PCR技术更好。
SNP研究大致分为两个部分，一是SNP数据库的建立，二是SNP功能的研究。
一种生物的所有SNP的数据库的建立是一件很大的工程，可以承担该工作的是那些具有大规模基因组测序能力的研究单位，而且数据库的建立很大程度上依赖Sanger法测序。
但众所周知，如果不研究每个SNP的功能，数据库的建立即SNP的发现就没有多大意义。
对已发现的SNP的功能的研究，有两个工作是必须的，一是SNP频率分析，一是SNP位点的碱基种类的证实.对于前者，Pyrosequencing是这样进行的:假设研究者手中有若干份来自不同个体的基因组DNA样品，要测这些不同样品的同一SNP的频率，那么研究者可以混合这些样本的基因组DNA，然后做一次PCR，进行一次测序，研究者就可以得到该SNP在这些样本中的频率.如果研究者已经有了各个样本的PCR产物，也可以将PCR产物混合后进行一次PYRO，就可以知道该SNP频率.已有的文献已经做过高达1126样本的PCR产物的混合来确定SNP的频率[2]。
这种做法极大地减少了研究者的实验次数和实验消耗。
一些其他研究也利用Pyrosequencing 技术来确定SNP频率[3，4]。
如果是SNP位点的碱基种类的证实，需要首先得到特定SNP所在DNA片段，即PCR产物，然后在SNP位点的上游和/或下游设计测序引物，这样通过对十几个bp序列测定来确定SNP位点的碱基种类及SNP位点上下游十几个碱基的序列.诸如四倍体马铃薯的一些SNP分析[5]和用于法医研究的线粒体DNA SNP分析[6]也是利用Pyrosequencing技术进行的。
注：转自生物通--黄文晋博士
最早开发出这一技术并将该技术商业化的是biotage 公司我们现在采用的就
是他们的仪器，给大家介绍一下它的有点（我可不是要卖这个仪器啊）
焦磷酸测序测序仪
系统用途：
多用途遗传分析系统，可应用于各种遗传多态性标记的分析检测，如SNP、突变、插入/缺失、甲基化、基因拷贝数等；等位频率分析；此外，还可应用于各种微生物的鉴定、分型、耐药性评估，并可对多种亚型或野生株及突变株、耐药株组成的复杂群体中的各个组分含量直接加以定量评估；
1.工作环境
1.1 环境温度：18- 28 °C
1.2 相对湿度：30 %-90 %
1.3 适用电源：220V，50Hz，最大功率280W
2.技术指标
2.1 系统功能指标
2.1.1 多用途：可进行SNP分析，突变检测，缺失和插入分析，CpG岛甲基化分析,细菌、病毒鉴定和分型，耐药性分析等，并且有多篇高水平论文支持。
2.1.2 * 采用DNA测序的原理来进行SNP分析，在得到SNP基因型的同时，还可得到多态性位点上下游的序列信息作为参照。
2.1.3 * 通过实时测序的原理得到DNA序列信息，不需要任何电泳或荧光标记。
2.1.4多重分析功能：可以将三个不同的SNP位点放入一个样品孔中进行检测，降低实验成本，进一步提高通量。
2.1.5 *只需一次反应，就可以给出分析2、3和4等位基因SNP的分析结果。
2.1.6 * 等位基因频率分析：可以使用Pooling策略，在一次反应中混合成百，甚至上千份DNA样本，进行等位基因频率分析，加快实验进程，降低成本，频率分析可检出低至5％的频率。
2.1.7 * 检测速度：十分钟左右完成96个样本SNP分析。
2.1.8 通量灵活，易于调节：每次可以选择运行1－96个样本，每个样本可进行不同的SNP位点分析。
2.1.9准确性和重复性：准确性99.95％以上，重复性几乎为100％。
附带上面文章的一章图片。