测定α-淀粉酶活力的方法

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响

一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。

二、实验原理

酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。

能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。

酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。

食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。

本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。

三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响

（一）试剂及材料

1、1：30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸馏水稀释。

2、0.2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。

3、1%NaCl溶液称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至100mL 。

4、1%CuSO4溶液称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。

5、标准稀碘液称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。吸取2mL 上述碘液，加入10 g碘化钾，用水稀释至500 mL。（二）仪器设备电热恒温水浴锅。

（三）操作方法

取试管3根，编号后按下表配置实验样液。

用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。

四、温度与PH值对α-液化淀粉酶活力的影响

（一）试剂与材料

1、2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2.0g（预先在105℃烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。

2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液

（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。

（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。

3、供试酶液的制备称取固体α-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓

冲溶液100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成)，于40℃恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。

4、标准比色液

甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g，溶解并定容至500mL。

乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。

使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新配置。

5、标准稀碘液。

（二）仪器设备电热恒温水浴锅。

（三）操作方法

1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。

2、不同温度对α-液化淀粉酶活力的影响

取4根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。

加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。

3、不同PH值对α-液化淀粉酶活力的影响

取5根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。

其它操作与温度对酶活力影响实验相同。 五、结果计算和讨论

淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g 酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。

酶活力单位(U/g)=

n t ⨯⨯⨯⨯5

.01

02.02060 式中：20——可溶性淀粉的用量（mL ）； t ——酶解反应完成所需的时间（min

）； 0.5——测定时稀释酶液用量（mL ）； 0.02——可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL ）； n ——酶制剂稀释倍数

1、不同温度对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录

2、不同pH 值对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录