蛋白质变性与沉淀时
盐析沉淀蛋白质时
收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 • 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色
蛋白质的分离与纯化方法
分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）
最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作 用下从溶液中沉降下来。
沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。
v s = ————
ω2x
v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶
1. 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称 为盐析。
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
紫色 红色
N 胍基
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反 应)
茚三酮反应
碱性CuSO4及磷钨 酸-钼酸 茚三酮
蓝色 蓝色
酚基、吲哚基 自由氨基及羧基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
Tyrห้องสมุดไป่ตู้
6实验1-2 蛋白质的性质实验
实验1－2 蛋白质的性质实验（二）蛋白质的沉淀反应一、目的和要求：1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、原理在水溶液中的蛋白质分子由表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类：（1）可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质，提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大变化，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中，加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、操作方法：（1）蛋白质的盐析加5％卵清蛋白溶液2毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀，倒出少量浑浊沉淀，加少量水，是否溶解？为什么？将管内溶液过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，再观察沉淀的再溶解。
（2）重金属离子沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入3％AgNO31—2滴，振荡试管，有沉淀生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？注意使用醋酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时不可过量，否则引起沉淀的再溶解，不妨以实验验证之，取一支试管加入约1毫升蛋白质溶液，加入1％CuSO4观察至有沉淀，再继续加入过量的CuSO4，观察沉淀消失，当然也可用0.5％的醋酸铅进行验证。
（3）某些有机酸沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
生化论述题
1. 什么是蛋白质变性？简单叙述变性与沉淀的关系。
在某些理化因素作用下，蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性。
当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。
变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，但变性蛋白质容易沉淀。
2. 底物浓度对反应速度的影响答：在酶量恒定的情况下，酶促反应的速度主要取决于底物的浓度；底物浓度太低时，反应速度随着底物浓度的增加而上升，加大底物浓度，反应速度缓慢，底物进一步增高，反应速度不在随底物浓度的增加而加快，达到最大反应速度，此时酶的活性中心被底物饱和。
3. 请简述一下苹果酸-天冬氨酸穿梭的过程。
胞浆中生成的NADH在苹果酸脱氢酶的作用下，使草酰乙酸还原成苹果酸，后者通过线粒体内膜上的苹果酸-α-酮戊二酸转运体进入线粒体，又在线粒体内苹果酸脱氢酶的作用下重新生成草酰乙酸和NADH。
NADH进入NADH氧化呼吸链进行氧化磷酸化，生成2.5分子ATP。
线粒体内生成的草酰乙酸经天冬氨酸氨基转移酶的作用生成天冬氨酸，后者经谷氨酸天冬氨酸转运体运出线粒体再转变成草酰乙酸，继续进行穿梭。
苹果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于肝和心肌组织中。
4. 糖异生过程是否为糖酵解的逆反应？为什么？糖异生不是糖酵解的逆反应。
糖酵解过程中有三步不可逆反应，在糖异生途径之中须由另外的反应和酶代替。
这三步反应是:①丙酮酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸，有2个反应组成，分别由丙酮酸所化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化;②1，6-双磷酸果糖转变成6-磷酸果糖，由果糖双磷酸酶催化③6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖，由葡萄糖-6-磷酸酶催化5.什么是乳酸循环？乳酸循环的生理意义是？肌肉特别是在缺氧收缩时产生大量的乳酸,乳酸经血液运输到肝,在肝中进行经糖异生,再生成葡萄糖释入血液,可再回到肌肉,就构成乳酸循环。
乳酸循环的形成的是由肝脏和肌肉中的酶的特点所致。
蛋白质沉淀反应实验
蛋白质沉淀反应实验集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质的沉淀反应一、目的和要求1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识2、掌握几种沉淀蛋白质的方法3、了解蛋白质变性与沉淀的关系二、沉淀反应（一）原理在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。
但这种稳定的状态是有条件的。
在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。
蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：1、可逆沉淀反应沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显着变化。
在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。
属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。
2、不可逆沉淀反应蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。
重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
（二）盐析1、材料与试剂（1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液（3）固体硫酸铵（4）滤纸、玻棒2、操作方法（1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。
此沉淀物为球蛋白。
（2）取上清液于另一支试管。
（3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。
静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。
（4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。
（三）重金属盐沉淀重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀：重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。
实验一蛋白质变性凝固及沉淀(WT)
蛋白质的变性、凝固及沉淀
生物化学与分子生物学教研室
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实验目的
能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法
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主要实验内容
蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应
蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质
变性实质：
高浓度尿素、盐酸胍等
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、
分子量不变）。
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变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。
不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。
利的保存 保护体内蛋白质
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蛋白质的胶体性质及沉淀:
不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。
大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 盐析是一个可逆沉淀反应。
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实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液；
② 加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置3min。
观察现象（
）
③ 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 取部分转入另一只试管中；
④ 向一只试管中加入结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不 再溶解（成为饱和(NH4)2SO4溶液）；
⑤ 比较两只试管现象（
）
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蛋白质沉淀反应
重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶 性蛋白盐而沉淀。
1. 向1号管中加入：pH4.8缓冲液10d 。混匀，于酒精灯
蛋白质的沉淀反应剖析
3．有机酸沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察 沉淀的生成。
4．有机溶剂沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
5、乙醇引起的变性与沉淀： 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：
试剂（mL）
试管编号
1
2
3
蛋白质溶液
1.0
1.0
1.0
pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液
1.0
—
—
0.1mol/L氢氧化钠溶液
—
1.0
—
0.1mol/L 盐酸溶液
—
—
1.0
95%乙醇
2.0
2.0
2.0
摇匀后，观察是否有沉淀生成。放置片 刻，向各管内加水4mL，然后在2，3号管中 各加1滴甲基红，观察颜色的变化。 接着2 号管用0.1mol/L醋酸溶液中和， 3号管用 0.05mol/L碳酸钠溶液中和，观察颜色的变 化和沉淀的生成。最后各管再加0.1mol/L盐 酸溶液数十滴，观察沉淀的再溶解。
观察沉淀是否溶解，为什么？ 向另一离心管的上清液添加硫酸铵粉末，边
加边搅，直至硫酸铵粉末不再溶解达到饱和为 止，此时析出的沉淀为清蛋白。静置5min 后， 离心（3000r/min） 10min，倒去上清液，向 沉淀中加少量水，观察沉淀是否溶解。
2．重金属盐沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入 2滴3%硝酸银溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应 指蛋白质分子的结
构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素 后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中， 并保持其天然性质而不变性。例如大多数蛋 白质的盐析作用或在低温下用乙醇（丙酮） 短时间作用于蛋白质等。提纯蛋白质时，常 用此类反应。
蛋白质的沉淀反应
3．有机酸沉淀蛋白质： ．有机酸沉淀蛋白质： 支试管， 蛋白质溶液， 取1支试管，加入 支试管 加入2mL蛋白质溶液，再加 蛋白质溶液 三氯乙酸溶液， 入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察 三氯乙酸溶液 振荡试管， 沉淀的生成。 沉淀的生成。 4．有机溶剂沉淀蛋白质： ．有机溶剂沉淀蛋白质： 支试管， 蛋白质溶液， 取1支试管，加入 支试管 加入2mL蛋白质溶液，再加 蛋白质溶液 乙醇。 入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。 乙醇 混匀，观察沉淀的生成。
试剂和器材 1. 试剂： 试剂：
(8) 0.1 mol/L盐酸溶液； 盐酸溶液； 盐酸溶液 (9) 0.1 mol/L氢氧化钠溶液； 氢氧化钠溶液； 氢氧化钠溶液 (10) 0.05 mol/L碳酸钠溶液； 碳酸钠溶液； 碳酸钠溶液 (11) 0.1 mol/L醋酸溶液； 醋酸溶液； 醋酸溶液 (12) 甲基红溶液； 甲基红溶液；
离子或某些有机酸的反应都属于此类反应。 离子或某些有机酸的反应都属于此类反应。 蛋白质变性后， 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳 定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。 ），并不析出 定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。 因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀， 因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀， 而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
2. 器材： 器材：Fra bibliotek离心机、离心管、试管、试管架、吸管、 离心机、离心管、试管、试管架、吸管、 滴管等。 滴管等。
四、结果： 结果：
写出实验过程中观察到的现象并加以解释。 写出实验过程中观察到的现象并加以解释。
试剂和器材 1. 试剂
(1) 蛋白质溶液： 蛋白质溶液： 新鲜鸡蛋清∶ 溶液=1∶ 新鲜鸡蛋清∶5% NaCl溶液 ∶9 溶液 (2) 饱和硫酸铵溶液； 饱和硫酸铵溶液； (3) 硫酸铵结晶粉末； 硫酸铵结晶粉末； (4) 3%硝酸银溶液； 硝酸银溶液； 硝酸银溶液 (5) 5%三氯乙酸溶液； 三氯乙酸溶液； 三氯乙酸溶液 (6) 95%乙醇； 乙醇； 乙醇 (7) 0.2 mol/L pH4.7醋酸 醋酸钠缓冲溶液； 醋酸-醋酸钠缓冲溶液 醋酸 醋酸钠缓冲溶液；
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6
（三）重金属盐类沉淀蛋白质
❖ 溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类 (如 Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白 质结合成不 溶性盐而沉淀。
❖ 重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常 用重金 属盐除去液体中的蛋白质。但应注意， 在使用某些 重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉 淀蛋白质时，不可 过量，否则将引起沉淀再 溶解。此时的溶解为生成 憎水胶体的缘故。
❖ 溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸 的作用最为灵敏而且特异。因此被用于蛋白质的首 选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物， 加热可除去。
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8
三、实验材料
❖ 实验材料： 鸡卵清蛋白液，吸管（1mlx4， 2mlx4，0.5mlx1， 5mlx2），试管 （1.5x15cmx14），水浴锅，滴管，电炉
❖ 实验试剂： 苯酚（0.5%），硫酸铜（1%）， 硫酸铵固体，95%乙 醇，NaCl，醋酸铅，鞣 酸，苦味酸，冰醋酸
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9
四、操作步骤
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10
五、问题与讨论
❖ 1、本次实验结果如何？ ❖ 2、蛋白质可逆沉淀和不可逆沉淀有什么区别？
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11
?蛋白质的变性与沉淀之间没有必然联系蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应一蛋白质的盐析作用二乙醇沉淀蛋白质三重金属盐类沉淀蛋白质四生物碱试剂沉淀蛋白质蛋白质沉淀反应一蛋白质的盐析作用?加盐类如硫酸铵硫酸钠氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜同时又中和了蛋白质分子的电荷因此使蛋白质产生沉淀这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析
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《生物化学简明教程》附带的习题答案zq整理版
《生物化学简明教程》附带的习题答案（一）用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？解答：（1）N-末端测定法：常采用2，4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。
（2）C―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
（二）何谓蛋白质的变性与沉淀？二者在本质上有何区别？解答：蛋白质的变性：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变的作用。
变性的本质：分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。
蛋白质变性后的表现：①生物学活性消失②理化性质改变：溶解度下降，黏度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
沉淀机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。
蛋白质的沉淀可以分为两类：（1）可逆的沉淀：蛋白质的结构未发生显著的变化，除去引起沉淀的因素，蛋白质仍能溶于原来的溶剂中，并保持天然性质。
（2）不可逆沉淀：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质变性而沉淀，不再能溶于原溶剂。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在，并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已经变性。
（三）一个α螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有多少圈螺旋？计算该α-螺旋片段的轴长。
解答：180/3.6=50圈，50×0.54=27nm，该片段中含有50圈螺旋，其轴长为27nm。
（五）如果人体有1014个细胞，每个体细胞的DNA含量为6.4 × 109个碱基对。
试计算人体DNA 的总长度是多少？是太阳―地球之间距离(2.2 × 109 km)的多少倍？已知双链DNA每1000个核苷酸重1 ×10-18g，求人体DNA的总质量。
实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应
2
3 4
8.7
8.0 7.4
-
0.3
1.0 -
—
— 1.6
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，
加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次
为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分 钟后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀） 的一管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质沉淀实验
不可逆沉淀反应
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，
蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂
中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液 稳定的条件仍然存在（如电荷），并不
析出。因此变性蛋白质并不一定都表现
为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变
饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球
蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水， 观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤， 向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此 时析出的沉淀为清蛋白。
• 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的
再溶解。
• 2．重金属离子沉淀蛋白质： 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的 复合物。 • 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加
性。
三、试剂器材
1、实验材料： 2、仪器设备：
鸡蛋清
牛乳
• 水浴锅
• 温度计 • 锥形瓶 • 100mL容量瓶 • 吸管
• 试管及试管架
3、试剂
• 0.4% 酪蛋白乙酸钠溶液
取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨， 将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用 少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入 锥形瓶内。加入10mL 1mol/L醋酸钠溶液。把锥形 瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到 酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移 到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
蛋白质的沉淀与变性实验报告
蛋白质的沉淀与变性实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质沉淀和变性的原理及方法。
2、观察蛋白质沉淀和变性的现象，区分二者的不同。
3、了解影响蛋白质沉淀和变性的因素。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子化合物，其分子表面带有许多可解离的基团，如氨基、羧基等，在一定的溶液 pH 值条件下，这些基团会解离而使蛋白质带电。
此外，蛋白质分子还具有亲水基团，能够与水分子形成氢键，从而使其溶解于水溶液中。
当溶液的条件发生改变时，如加入某些试剂、改变溶液的 pH 值、温度等，蛋白质的性质会发生改变，可能会出现沉淀或变性的现象。
蛋白质沉淀是指蛋白质分子从溶液中析出的过程，其原因可能是由于蛋白质分子表面电荷被中和、水化膜被破坏等。
蛋白质沉淀后，如果去除引起沉淀的因素，蛋白质可以重新溶解，恢复其原有的性质。
蛋白质变性是指蛋白质在某些物理或化学因素的作用下，其空间结构被破坏，从而导致其生物活性丧失的现象。
蛋白质变性后，通常不能再恢复其原有的结构和功能。
三、实验材料与仪器1、材料鸡蛋清溶液牛奶饱和硫酸铵溶液乙醇硝酸银溶液硫酸铜溶液氢氧化钠溶液盐酸溶液乙酸铅溶液2、仪器试管滴管玻璃棒酒精灯恒温水浴锅四、实验步骤（一）蛋白质的沉淀实验1、盐析沉淀取两支试管，分别加入 2ml 鸡蛋清溶液。
向其中一支试管中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加边振荡，直至出现沉淀。
静置一段时间，观察沉淀现象。
2、有机溶剂沉淀取两支试管，分别加入 2ml 牛奶。
向其中一支试管中逐滴加入乙醇，边加边振荡，直至出现沉淀。
静置一段时间，观察沉淀现象。
3、重金属盐沉淀取三支试管，分别加入 2ml 鸡蛋清溶液。
向第一支试管中滴加几滴硝酸银溶液，向第二支试管中滴加几滴硫酸铜溶液，向第三支试管中滴加几滴乙酸铅溶液。
观察沉淀现象。
4、生物碱试剂沉淀取两支试管，分别加入 2ml 鸡蛋清溶液。
向其中一支试管中滴加几滴氢氧化钠溶液，向另一支试管中滴加几滴盐酸溶液。
观察沉淀现象。
蛋白质变性与沉淀.
蛋白质沉淀析出常用的方法有 等电点法、盐析法、重金属离子沉 淀法、有机酸试剂沉淀法、有机溶 剂沉淀法等。
（二）蛋白质变性原理 蛋白质受某些物理或化学因 素的影响，空间结构发生改变， 生物活性丧失。称为蛋白质变性。
蛋白质变性，分可逆；不可逆。
三、实验仪器与试剂
1.仪器 试管、刻度吸量管、洗耳球等。 2.试剂 5％蛋白质溶液、 2.5％蛋白质 溶液、10％ZnSO4溶液、 o.1mol/LNaOH、 1％三氯醋酸、无 水乙醇、NaCl（固体）
四、实验内容及操作步骤
（一）实验内容
1.重金属盐及有机酸类沉淀蛋白质 2.乙醇沉淀蛋白质 （二）操作步骤
1.重金属盐及有机酸类沉淀蛋白质
1）实验原理 负电荷
CO O -
O HP
CO O-
盐↓
重金属离子M
+ P
C O O -M + NH2
pH > pI
P
+
NH2 CO O H P
H
+
酸 根X
P
CO OH
六、思考题
1.临床抢救重金属中毒患者， 为什么用鸡蛋清或牛奶？ 2.蛋白液中加入适量乙醇，为 什么会产生沉淀？ 3.蛋白液在碱性条件下加入 ZnSO4 ，为什么会产生沉淀？ 4.蛋白液中加入三氯醋酸 ，为 什么会产生沉淀？
下次实验： P74页
激活剂及抑制剂对酶活性的影响 实验报告明天交，请组长负起责 任。谢谢同学们配合！
N H3
pI
pH < pI
N H3+源自两性离子正电荷盐↓
N H3 X
+
-
2）操作步骤
试剂（滴） 试管1 试管2 试管3
5%蛋白质溶液 0.1mol/L NaOH
实验二蛋白质的沉淀作用及可逆
10% NaOH 溶液
蒸馏 水 7 2 2
－ 5
1 2 3
4 5
10 10 10
10 10
－ 5 －
－ －
－ － 5
5 －
－ － －
2 －
－ － －
－ 2
加毕，将各管混匀，观察、记录各管现象后，然后放入 100℃恒温水浴中保温（或沸水浴中）10 min，注意观 察、比较管的沉淀情况。然后，将第3，4，5号管分别 用10％NaOH溶液或10％乙酸溶液中和，观察并解释实 验结果。
2、实验器材
(1)试管; (2) 试管架; (3)小玻璃漏斗; (4)滤纸; (5)玻棒 (6)烧杯; (7)量筒; (8)恒温水浴箱
四、操作方法
1、蛋白质的盐析 加蛋白质氯化钠溶液3 ml于试管中，再加等量的饱 和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟则析出球蛋白的沉淀。 倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解。将管中 内容物过滤，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边 用玻璃棒搅拌．直至粉末不再溶解为止，此时析出的沉 淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉 淀的再溶解。 2、重金属离子沉淀蛋白质 取2支试管，各加入蛋白质溶液1 ml，再分别加 5%硝酸银溶液和1％硫酸铜溶液1-2滴，振荡试管，有 沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量 的水，观察沉淀是否溶解？
思 考 题
剂 i ]
1、沉淀、变性之间有什么样的关系？哪些沉淀往往伴 随变性？ 2、鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解毒剂？ 3、氯化汞为何能做为杀菌剂？
5、生物碱试剂沉淀蛋白质
取试管2支，各加入1 ml蛋白质溶液及1％乙酸溶液2—3滴。 向一管中加入5%鞣酸溶液数滴，另一管加入饱和苦味酸溶液数滴， 观察结果。
实验一蛋白质变性凝固及沉淀(WT)
蛋白质的加热变性凝固
蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化，疏 水基团暴露于分子表面，溶解度降低。
当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下）， 则蛋白质发生聚集出现沉淀；
当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下）， 则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀；
精品课件
实验内容
取三只小玻璃试管，各加入10%蛋白质溶液 10d，分别标记为1、2和3号管；
实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； ② 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀； ③ 逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。
精品课件
蛋白质沉淀反应
生物碱试剂沉淀蛋白质
在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、 钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝 酸)结合成不溶性的盐沉淀，此时蛋白质带正电荷 易于与酸根负离子结合成盐。
变性实质：
高浓度尿素、盐酸胍等
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、
分子量不变）。
精品课件
变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。
不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。
利用 避免
消灭病原微生物
蛋白质制剂的保存 保护体内蛋白质
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蛋白质的胶体性质及沉淀:
结构和性质都发生变化 沉淀不再溶解于水
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蛋白质的凝固
蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固。 不可逆变性状态
精品课件
蛋白质变性、沉淀与凝固的关系
变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属于 一种现象
变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近 才沉淀
变性蛋白易于沉淀， 沉淀蛋白不一定变性 沉淀的变性蛋白质也不一定凝固
蛋白质的沉淀和变性实验
蛋白质的沉淀与变性反应目的(1)了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。
(2)学习盐析和透析等生物化学的操作技术。
原理在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。
但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。
在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。
这种反应可分为以下两种类型:一、可逆淀汲反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。
这种作用称为可逆沉淀反应，又叫作不变性沉淀反应。
属于这一类的反应有盐析作用; 在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等电点的沉淀等。
二、不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。
这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用叫作不可逆沉淀反应。
重金属盐、植物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
试剂和器材一、试剂1．蛋白质溶液取5m1鸡蛋蛋白蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4-8层纱布过滤，新鲜配制。
2．蛋白质氯化钠溶液取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。
硫酸铵粉末，饱和硫酸铵溶液，3%硝酸银，0.5% 醋酸铅，10% 三氯醋酸，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5% 磺基水杨酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，饱和氯化钠溶液，10%氢氧化钠溶液。
二、器材试管，试管架，小玻璃漏斗，滤纸，玻璃纸，玻璃棒，500ml烧杯，10 ml量筒。
生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应讲课文档
第十页，共38页。
安全布告
有辐射性
生物危险品
警告标志
第十一页，共38页。
有毒的
刺激性有害的
腐蚀性的
高度可燃的
爆炸性的
危险化学药品标志
第十二页，共38页。
有氧化作用的
化学药品的质量标签
氯化钠 优级纯
第十三页，共38页。
化学药品的质量标签
氯化钠
分析纯
第十四页，共38页。
生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应
第一页，共38页。
生物化学实验室规则（2）
6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，远离火源操作及 放置。
7、所有废液、废弃物等，均收集在指定容器内，不得倒在水槽 内或到处乱仍。强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀释 ，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。
– 实验报告 – 平时操作、表现
姓名，班级，学号，课室 ，实验时间、 实验教师
第二十页，共38页。
实验内容及安排 ( 72学时 )
1、绪论、蛋白质沉淀、变性反应
9月26-27
2、蛋白质浓度测定—考马斯亮蓝法
10月10-11
3、 阳离子交换树脂层析分离氨基酸
10月17-18
4、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
化学药品的质量标签
氯化钠
化学纯
第十五页，共38页。
实验室安全--避免烧伤和创伤
• 使用玻璃、金属器材时注意防止割伤及机械创伤。如发
生意外，找实验室工作人员(少量急用药物备用)。
• 浓酸、浓碱腐蚀性很强，必须极为小心地操作。用吸量
管量取这些试剂(包括有毒物)时，必须使用橡皮球，绝 对不能用口吸取。
蛋白质的性质实验(二)
蛋白质的性质实验(二)蛋白质的性质实验(二)蛋白质的性质实验（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定1．目的（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。
2．原理蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3．器材4．试剂（1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200mL取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200 mL锥形瓶内，用少量40～50 ℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10 mL1 mol／L醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
5．操作（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
蛋白质的性质实验(二)（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。
此时1、2、3、4 管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性1．目的（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
生化实验 绪论及蛋白质沉淀变性反应(共38张PPT)
步骤
现象
取一支试管，加入3mL蛋白质氯 化钠溶液和等量的饱和硫酸铵溶 液，混匀，静置10分钟
过滤后，向滤液中加入硫酸铵粉 末，边加边用玻璃棒搅拌，直至 粉末不再溶解，直至饱和
静置，弃去上清液，取出部分清 蛋白，加少量蒸馏水
观察有无蛋白质 （球蛋白）的沉淀
观察有无沉淀（清 蛋白）析出
观察沉淀的再溶解
解释结论
• 实验报告分为以下几局部：
• 原理
• 实验步骤 • 结果与讨论 • 问答 • 实验成绩的评定： • 实验报告
• 平时操作、表现
姓名，班级，学号，课 室，实验时间、
实验教师
实验内容及安排 ( 72学时 )
1、绪论、蛋白质沉淀、变性反响
9月26-27
2、蛋白质浓度测定—考马斯亮蓝法
10月10-11
3、 阳离子交换树脂层析别离氨基酸
生物化学实验室规那么〔1〕
1、遵守纪律，不得无故迟到、早退、大声谈笑。 2、预习，熟悉实验目的、原理、步骤。 3、严格听从教师的指导，及时记录实验原始数据。 4、实验场所整洁、公用试剂用后放回原位，实验完毕，清洗实
验器皿、收拾台面，方可离开。 5、注意节约试剂，防止损坏仪器。使用贵重仪器时，严格遵守操
作规程，发现故障，立即报告教师，不得擅自检修。
生物化学实验室规那么〔2〕
6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，远离火源操作及放置。 7、所有废液、废弃物等，均收集在指定容器内，不得倒在水槽内或
到处乱仍。强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀释，然后倒入 水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。 8、室内严禁吸烟！煤气、水管用完即关。
强碱：先用大量自来水冲洗，再用5%硼酸溶液或
的潜在危害，处理生物材料必需小心谨 1%硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.
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1％三氯醋酸、无水乙醇、NaCl（固体）
四、实验内容及操作步骤
（一）实验内容 1.重金属盐及某些酸类沉淀蛋白质
2.乙醇沉淀蛋白质
（二）操作步骤及原理
1.重金属盐及某些酸类沉淀蛋白质 1）实验原理
COO OH P NH 2 P
+
COO -
重 金属离子 M
+ P
COO -M +
NH 2 P COO H
H
+
COOH
酸 根X
NH 3
P
NH3
+
NH3 X
+
-
2）操作步骤
试剂（滴） 5% 蛋白质溶液 试管1 2滴 试管2 2滴 试管3 2滴
0.1mol/L NaOH
10% ZnSO4
2滴
20滴
—
—Hale Waihona Puke —20滴1% 三氯醋酸
现象
—
20滴
—
3）观察、记录实验现象，并解释之。
2.乙醇沉淀蛋白质
1）实验原理
乙醇溶解于水，破坏蛋白质
实验项目 蛋白质变性与沉淀 2学时
一、实验目的
1.掌握蛋白质变性与沉淀两者 的关系；
2.熟悉刻度吸量管的正确使用； 3.了解蛋白质变性与沉淀的原
理及各种沉淀方法。
二、实验原理
（一）蛋白质变性
蛋白质受某些物理或化学因 素的影响，空间结构发生改变，
生物活性丧失。称为蛋白质变性。
（二）蛋白质沉淀：
使蛋白质从溶液中析出的现象。
1、盐析 2、重金属盐沉淀
3、有机酸试剂沉淀法
4、有机溶剂沉淀法
维持蛋白质胶体溶液稳定因素： 1.水化膜
2.颗粒表面电荷
去除上述稳定因素可使蛋白质沉淀析出。
三、实验仪器与试剂
1.仪器
试管、刻度吸量管、洗耳球等。 2. 试剂
5％蛋白质溶液、 2.5％蛋白质溶液、
10％ZnSO4溶液、 0.1mol/LNaOH、
分子的水化膜，加入少量中性盐 抑制蛋白质的解离，使电荷减少，
沉淀更完全。
2）操作步骤
试剂（mL） 2.5%蛋白质溶液 结晶NaCl 无水乙醇 试管1 0.5 mL — 1mL 试管2 0.5 mL 数粒（适量） 1mL
现象
3）观察、记录实验现象，并解释之。
五、注意事项
1.试剂滴管不能交叉使用，防污染试剂 2.刻度吸量管不能交叉使用，否则污染
试剂，影响反应现象。
3.做完实验把试管和试管架洗干净，
桌面擦干净，登记签名。
4.值日生听老师安排，认真打扫，经老 师批准才能离开实验室。
六、思考题
为什么临床抢救重金属中毒患者用 鸡蛋清或牛奶？
下次实验： 激活剂和抑制剂对酶活性
的影响 实验报告可以下课交，最晚 明天交，请组长负起责任。
谢谢同学们配合！