细胞色素C的制备测定及SDS—PAGE纯度鉴定

细胞色素C的制备测定及SDS—PAGE纯度鉴定

摘要：本文研究细胞色素C的制备及测定方法和SDS-PAGE测定蛋白质分子质量及纯度鉴定，以猪心未原料，采用离心、透析、抽提、抽滤、沉淀等技术，制备出细胞色素C，然后用消光法，紫外吸收法测得细胞色素C的产量，蛋白质的总含量。再运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定细胞色素C的分子质量。实验结果细胞色素C的产量为8.84mg，产率为60.86mg/kg,蛋白质浓度为0.722mg/ml,纯度为38.04%，细胞色素C的分子质量为12417，相对误差为0.14%。

关键词：细胞色素C 离心抽提抽滤透析消光法紫外吸收法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯度

前言：细胞色素C是一种细胞色素C(Cytochrome C)是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,是呼吸链中的一个基本成分,广泛存在于所有的需氧组织中。一般说来,组织的细胞色素C的含量与它们的呼吸活性大致成平行关系,在心肌与其它作剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。在细胞内细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,是线粒体电子传递链中重要成员,在生物氧化过程中起着重要作用。细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂,早期研究发现在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态,在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢,使细胞恢复正常呼吸,病情得到缓解或痊愈目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。本实验以猪心为原料，向心肌中加入三氯乙酸溶液中，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则存留在三氯乙酸溶液中。将硫酸氨粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白，血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C则仍留于溶液中。进一步用三氯乙酸酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。鉴定及测定细胞色素C用消光法。在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9*10^4/克分子/厘米，还原型细胞色素C：K2=2.77*10^4/克分子/厘米，样品较纯时，从氧化型转变为还原型或者还原型转变为氧化型，消光值的情况相同。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入了离子去污剂和强还原剂，使SDS蛋白质络合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小。当蛋白质的分子质量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

正文：

1.材料与方法

1.1原料：农贸市场购买的猪心

1.2仪器：PHILIPS 组织捣碎机

SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）

LXJ-ⅡB 离心机（上海安亭科学仪器制造厂）

透析袋 MD44

V-2100 紫外分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）

721分光光度计（上海第二仪器制造厂）

JB-3型定时恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）

DYY-11 型电泳仪（北京市六一仪器厂）

微量进样量 25 ul （上海注射三厂）

TY—80A /S 脱色摇床（金坛市江南仪器厂）或 ZD-9556 水平摇床（太仓市科

技器材厂）

移液枪 5-50 ul，移液枪 20-200 ul

1.3试剂：硫酸铵粉末，10%氢氧化钠溶液，0.145mol/L三氯乙酸溶液，0.1mol/L pH 7.4磷酸钠缓冲液，铁氰化钾溶液，饱和的连二亚硫酸钠溶液，丙烯酰胺储存液（A液），分离胶缓冲液（B液），堆积胶缓冲液（C液），10%过硫酸铵，TEMED，染色液，脱色液

1.4方法：

1.细胞色素C的制备

取猪心一个，剔除脂肪，称量，绞碎，加入1：1量的0.145mol/L的三氯乙酸溶液搅匀。将此混合抽提物于室温下放置3小时，然后用细布过滤。用10%氢氧化钠溶液将上述混合液调到pH 7.3，测量并记录此抽提液的体积，再于搅拌下慢慢地加入硫酸铵粉末（加入量按500克/升混合液计算）用布氏漏斗抽滤，除去沉淀，收集粉红色滤液。测量并记录此滤液的体积，搅拌下再加入硫酸铵粉末，（加入量按50克/升滤液计算）。此盐析液于冰箱中放置过夜。上述盐析液经放置后出现少量沉淀，用布氏漏斗抽滤（双层滤纸），除去沉淀，保留上清液，向上清液中加入20%三氯乙酸溶液（加入量按25克/升上清液计算），以沉淀细胞色素C。迅速地从3500转/分条件下离心10分钟，收集细胞色素C沉淀，再将这个砖红色的沉淀悬浮于饱和硫酸铵溶液中（饱和硫酸铵的体积按150毫升/公斤心肌组织计算，可根据实验操作情况减少30-50%）。将此悬浮液移于透析袋中，对水透析4-5小时，离心（3500转/分，10分钟）除去少量暗黄色沉淀，记录此溶液的体积。

2．测定细胞色素C的产量，纯度及产率

氧化型样品的消光值E1：按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出氧化型样品的消光值。

试剂样品（毫升）空白（毫升）

0.1mol/L pH 7.4磷酸钠缓冲液 3.8 5.8

适当稀释的细胞色素C溶液 2.0 0

铁氰化钾溶液0.2 0.2

还原型样品的消光值E1：按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出还原型样品的消光值。

试剂样品（毫升）空白（毫升）

0.1mol/L pH 7.4磷酸钠缓冲液 3.8 5.8

适当稀释的细胞色素C溶液 2.0 0

饱和的连二亚硫酸钠溶液0.2 0.2

测定体积为6毫升，细胞色素C的体积为V，则细胞色素C氧化型及还原型的产量分别为：Y1（毫克）=E1/K1*M*6*V*稀释倍数

Y2（毫克）=E2/K2*M*6*V*稀释倍数

细胞色素C的分子质量M为12400。如果产品较纯Y1与Y2应当相等。由以上结果可以算出产率：产率=产量（毫克）/心肌重量（公斤）

用紫外吸收法测定细胞色素C溶液的总蛋白含量，可与消光法测出的数据进行核对比较，求出其样品的最终浓度：

纯度%=消光法测出的产率（毫克）/蛋白含量测定的总蛋白含量（毫克）

3．测定产品的分光光度吸收值

测定细胞色素C溶液的光吸收峰。将操作2中的氧化型及还原型溶液取来测定可见光不同波