实验9紫外线对微生物生长的影响及抗生素对微生物生长的最低抑制浓度的测定

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实验九紫外线对微生物生长的影响

抗生素对微生物生长的最低抑制浓度的测定及硫化氢产生实验

杨明轩生物111 28

一、实验目的

1、了解并掌握紫外线和抗生素杀灭微生物细胞的原理。

2、学习和掌握应用紫外线杀菌的实验操作步骤。

3、学习并掌握采用液体培养技术测定药剂对微生物的最低抑制浓度的方法。

4、通过了解不同细菌对含能产硫化氢半固体培养基的分解利用情况，结合实验八的结果，认识微生物代谢类型多样性。

二、实验原理

紫外线是杀菌效率较强的物理因素。其原理是，紫外线可以直接作用于细胞内的DNA分子，使同一DNA链上相邻的嘧啶形成胸腺嘧啶二聚体，因而导致双链DNA结构发生变化，使DNA的正常复制受到影响，最终导致细胞死亡。紫外线的杀菌效果与照射剂量呈正相关，即紫外灯的功率、照射时间和照射物品距紫外灯的距离等因素都会影响杀菌效果。虽然紫外线具有很好的杀菌效果，但其穿透能力不强，一层黑纸即可阻挡紫外线的通过，因此紫外线常用于室内空气灭菌或器皿的表面灭菌。本实验采用平板法验证紫外线的杀菌作用和不同微生物对紫外线的耐受性。

很多化学药剂都能够抑制微生物的生长。最低抑制浓度（MIC）是指药物抑制微生物生长的最低浓度，由于微生物对药物的耐受性不同，因此最低抑制浓度是有差异的。可以通过液体稀释法来测定最低抑制浓度。将一定培养液中加入不同浓度的药剂，配制成一定浓度梯度，再将制备好的菌悬液按一定体积接种，置一定温度培养后，可通过肉眼或分光光度计测定浊度，以不能生长菌株的试管内药剂的浓度为MIC。

三、实验材料

1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、

2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基、产硫化氢半固体穿刺培养基；

3、试剂：无菌水、10μg/μl链霉素；

5、仪器：无菌培养皿、无菌试管、刮铲、灭菌黑纸、。

四、实验方法

（1）紫外线对微生物生长的影响

1、将供试菌株接种于LB斜面，置37℃培养过夜。

2、将5ml无菌水分别注入菌种管内，混匀制成均匀的菌悬液，37℃振荡培养过夜。

3、取事先制备的LB平板3个，分别以菌悬液涂布一个平板，并做好标记。

4、取一灭菌的剪成五角星形状的黑纸放置在培养皿中央，将培养皿放于紫外灯箱内，打开皿盖，开紫外灯照射15min，盖好培养皿盖后将培养皿取出，注意将培养皿立即倒置于37℃温箱中培养过夜。

5、观察结果平纪录。

（2）抗生素对微生物生长的最低抑制浓度的测定

1、取活化好的菌种斜面，分别挑取一环接种于液体培养基中，在37℃下培养6~8h，作为测试液。

2、按下表配制不同链霉素浓度的培养基并按照顺序加样（每个试管3个重复），全班留一个只含培养基，不接菌也不用药的，做对照。

3、将试管置于37℃温箱培养12~24h，取出试管，充分震荡，用肉眼观察每个试管浊度，用“+”或“-”表示生长与否。也可用分光光度计检测浊度。

表1 不同链霉素浓度的培养基的配制

（3）硫化氢产生实验

取硫化氢产生试管半固体柱状培养基，穿刺接种S. aureus、B. subtilis、P. vulgaris，28℃培养2天。观察试管是否变黑（FeS沉淀）。

五、实验结果

（1）紫外线对微生物生长的影响

在黑纸覆盖的地方菌落生长良好。而大肠杆菌的平板在黑纸覆盖区域的边缘位置长有少量菌落，其他没有覆盖的地方也零星的长有菌落；而金黄色葡萄球菌平板在没有黑纸覆盖的地方几乎没有菌落的生长。

（2）抗生素对微生物生长的最低抑制浓度的测定

表2 抗生素对微生物生长的最低抑制浓度的测定的结果

因为实验操作中，对于CK管（药物浓度为0）忘记了加入菌液，导致CK管也为“－”，通过比照同班其他组数据，可知CK管由上表可知E. coli、S. aureus均为“＋＋＋”，而链霉素对大肠杆菌的MIC为0μg/ml，链霉素对金黄色葡萄球菌的MIC为80μg/ml。

（3）微生物对含硫化氢培养基的水解（见实验八实验报告汇总）

六、思考题

1、分析结果，比较并观察菌株对紫外线的耐受能力。

答：由上面的结果可知，大肠杆菌平板在无覆盖的区域也长有少量菌落，而金黄色葡萄球菌无覆盖区域几乎没有菌落生长。因此，大肠杆菌对紫外线的耐受能力比金黄色葡萄球菌更强。

2、为什么紫外线照射后应立即将培养皿放置于黑暗条件下培养？

答：紫外线可以直接作用于细胞内的DNA分子，使同一DNA链上相邻的嘧啶形成胸腺嘧啶二聚体，因而导致双链DNA结构发生变化。但在可见光的作用下，嘧啶二聚体能够被光裂合酶直接切开，也能够被光解作用恢复为单体形式，即为DNA损伤的光修复。直接黑暗培养能够避免光修复对实验结果造成影响。

3、分析操作因素会对结果有什么影响？

答：（1）涂菌时如果涂布器温度过高，则会造成菌体死亡，影响结果；

（2）如果黑纸盖得不严，留有缝隙，会造成纸下面的部分菌体死亡，得不到预期结果；

（3）紫外线照射时，紫外灯的功率、照射时间和照射物品距紫外灯的距离等因素都会影响结果；

（4）实验需要无菌操作，若引入杂菌，则会影响结果。

4、分析以上结果，判断两个测试菌株的抗药能力。

答：由上面的数据可知，链霉素对大肠杆菌的MIC为0μg/ml，对金黄色葡萄球菌的MIC 为80μg/ml。因此，金黄色葡萄球菌对链霉素的抗药性远比大肠杆菌对链霉素的抗药性要强。这也符合链霉素主要对革兰氏阴性菌起作用的药物特点。