PLFA的提取和鉴定

PLFA 的提取和鉴定

实验原理和目的

PLFA 原理

磷脂脂肪酸(PLFA)是活体微生物细胞膜的重要组分, 不同类群的微生物可通过不同的生化途径合成不同的PLFA 。一些PLFA 可作为分析微生物量和微生物群落结构变化的“生物标记”。

传统上微生物多样性研究多依赖于培养方法和显微技术,即采用选择性培养基从样品中分离出纯菌株后进行鉴定,获得可培养微生物的种类和数量信息。但该方法存在以下缺点:(1)许多微生物是不可培养的,分离鉴定到的微生物只占微生物总数很少一部分，因此,通过该传统方法只能得到微生物群落信息的极小部分(2)只能了解可培养的极少数微生物数量和群落结构,具有选择性且不能对大多数微生物定量研究(3)对于微生物群体相互作用研究的贡献很小。目前,磷脂脂肪酸(PLFA)分析被广泛地应用于微生物多样性研究。磷脂是所有生物活细胞重要的膜组分,在真核生物和细菌的膜中磷脂分别占约50%和98%。PLFA 是磷脂的构成成分,它具有结构多样性和生物特异性, PLFA 的存在及其丰度可揭示特定生物或生物种群的存在及其丰度。磷脂在细胞死亡后快速降解(厌氧条件下约需2 d,而好氧条件下约需12～16 d)。 故用以表征微生物群落中“存活”的那部分群体。

总之,通过对PLFA 的定量测定可完成对了解微生物活细胞生物量的测定。通过根据PLFA 分析的种类了解土壤、肠态微生物群落结构。

实验步骤

样品的采集和预处理

实验所需仪器和试剂：

聚四氟乙烯试管，涡旋器，玻璃试管，马弗炉两个，烧杯

正己烷

1.用2-3毫升正己烷清洗聚四氟乙烯试管，（清洗时需涡旋震动），再将它们放入马弗炉里干燥，玻璃试管处理同上（每6支试管换液一次）

2.将采集的粪样放入聚四氟乙烯管中进行液氮处理，干燥

3.磨碎样品混匀，置于-20摄氏度的冰箱中。

第一天

所需药品与器材：震荡器，离心机，移液管，玻璃试管，抽吸器，氯仿，磷缓冲液，甲醇，沙子，

1.将50支试管分为5组编号A-E ，每组10支编号1-10，并做如下处理（准确称量）：

2.在通风环境下将

3.6 mL 的磷缓冲液，4mL 的氯仿和8mL 的甲醇分别加入试管中（需3个5-10mL 的移液管）

3.在避光的条件下，震荡1个小时，用最大功率。注意避光保存 试管号

质量（g)

组号 A B C D E

1

0.5 1 1.5 2 2.5 2 0.5 1 1.5 2 2.5

4.离心分离，调整转速在3000 rpm，30分钟（注意平衡试管的质量）

5.在通风环境下，将离心后上清液转移到对应标号的新试管中，避免混淆

6.将3.6ml磷缓冲液和4ml的氯仿加入对应新试管中

7.震动1分钟（平衡气压）

8.放入-20摄氏度冰箱里避光保存。

第二天

所需药品器材：同第一天

1.在通风环境下，吸取上层三分之二出的液体（使用真空抽吸器），保留氯仿层（保证无水）

2.用氮气吹干氯仿层，尽可能的避光，可以适当加热促进挥发，但温度不能超过30摄氏度注意事项：在操作过程中尽量避免样品与氧气的接触

第三天

所需药品与器材：氯仿，甲醇，氮气源，滴瓶，玻璃试管，0.5ml玻璃移液管，沙子

1.移液：向提取后的液体中加入2ml氯仿，移入干净的试管中

（1）使用移液器，吸取0.5ml样液，用于清洗移液器，重复2-3次；

（2）使用清洗后的移液器，吸取0.5ml的样液，直接加入样品管的底部，注意使用过程中移液器一定避免污染；

（3）用涡旋的方法去除残留的脂肪酸；使用新的移液器，除去样品中的脂质，置于已标记的新的样品管中，保护好移液管；

（4）重复（2）-(3)过程3-4次至移液总量达两毫升（如果样品呈乳浊状，加入甲醇吸水，直至澄清，用量约0.5ml）

（5）在最后一次转移后，清洗移液管，切换样品时要清洗移液管

（6）干燥所有样品，可沙浴加热

注意保证样品的纯净，氮气低温，避光，储存

第四天

所需药品与器材：SPE层析柱，水槽，15ml的试管，沙子，氮气源，0.5ml的玻璃移液管，丙酮，氯仿，甲醇，8-10ml的带塞试管，

1.在通风环境下，组装好SPE层析柱装置，向层析柱中加入3ml的氯仿润洗

2.按照移液的步骤，将脂质移入层析柱中

3.向层析柱中加入5ml氯仿

4.向层析柱中加入大约10ml丙酮，使样品完全流出

5.用甲醇清洗层析柱底部尖端

6.关闭收集管进行式样确定，

7.向层析柱中加入5ml的甲醇，保留所得脂，并贴上标签和日期

8.用氮气吹干样品并将样品保存呢在-20摄氏度的冰箱中

第五天

所需药品与器材：甲苯和甲醇混合液（1:1），正己烷和氯仿混合液（1:1），0.2M的甲醇的氢氧化钾溶液，正己烷，醋酸，涡旋器，超纯水，PH试纸，玻璃瓶，离心机，4ml棕色试剂瓶，氮气源，沙子

1.在通风的环境下，向干燥的脂质溶解物中加入比例为1:1的甲醇和甲苯的混合剂，以及氢氧化钾的甲醇溶液，用玻璃移液管把试剂加到样品管的底部，轻微漩涡，使之充分混匀。（甲醇的氢氧化钾溶液需现配现用，混合溶液需提前配好且需充分混匀）

2.在35摄氏度下静置15分钟（可用水浴或沙浴或用烤箱，但最好不用水浴）

3.冷却至室温

4.使用移液管加入两毫升比例为4:1的正己烷和氯仿的混合溶液，混匀。

5.逐滴加入大约1ml 1M的醋酸中和样品，用石蕊试纸测定PH至中性。

6.加入2ml超纯水，加盖，涡旋震动，持续30秒，使混匀。

7.以3000rpm的速度离心约5分钟，使各相分离。

8.将上层的正己烷，注入规格为4ml棕色的GC管中，每份样品使用一个一次性的移液管，注意，移液管靠近它所属的样品，以便取用。（移液应注意，保留底相）

9.重复4,7,8步骤来洗净水相，除掉残留的脂质。

10.第二次加入正己烷至总量为4ml左右

11.氮气干燥45分钟，低温避光保存。

第六天

所需药品与器材：2ml棕色GC瓶，150ul玻璃衬管，40ml平底玻璃瓶，氮气源，正己烷1.将样品转移到2ml的GC管中，均分三份，全部转入玻璃衬管，移去100ul置于备用GC 瓶中，对样品进行分析。