肝糖原的提取、鉴定与定量

生物化学实验报告

姓名：汪煜灵

学号： 3130010071 专业年级： 2013级临床医学

组别：第2实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离

实验日期2014-12-25 实验地点第2实验室

合作者陈海玲指导老师朱利娜

评分教师签名批改日期

一、实验目的

1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4、熟练运用溶液混匀的各种方法。

5、正确掌握溶液转移的操作。

6、正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

●肝糖原的提取

糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。

●糖原的鉴定

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。

CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2

2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O

2CuOH = H20 + Cu2O (红色)

Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色)

●肝糖原的定量

糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。

该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。

三、实验材料

●仪器：

1、普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为

10mg级电子天平

2、剪刀、镊子、研钵

3、试管架，离心管，试管

4、刻度吸量管（2ml ,5ml），1000μl微量可调取液器

5、100ml容量瓶

6、白瓷反应板

●试剂：

鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂

四、实验步骤

● 肝糖原的提取

鸡肝约1.5g ，剪碎

研磨至乳状

研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心3min （4000r/min ）

取上清液

离心5min （

4000r/min ）

取沉淀

沸水浴2min ，溶解沉淀

沸水浴加热15min ，冷却

糖原溶液0.1ml

呈色对比

混匀

沸水浴2min ，观察变化 ● 注意事项：

1、提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4ml 多，加上等量

+5ml 95%乙醇，混匀，静置10min +5%CCl 3

COOH 1ml

+5%CCl 3COOH 3ml +蒸馏水2ml

+班氏试剂0.2ml(4d)

+浓HCl 0.2ml

乙醇，总量接近9ml ，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。

3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定

鸡肝 0.15 g

沸水浴15min

冷却，全部转入100ml 容量瓶中

加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液

取3支干净的试管，按下表操作：

试剂（ml ） 空白管 标准管 样品管 蒸馏水

1.0 —— —— 标准葡萄糖溶液 —— 1.0 —— 糖原提取液 —— —— 1.0 0.2%蒽酮溶液

2.5

2.5

2.5

混匀，沸水浴10min ，冷却。在722型或721型分光光度计620nm 波长处，用空

白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A ）.计算：

肝糖原（g/100g 肝组织）=标准测定A A X 0.05 X ）肝组织重（g 100 X 1000

100

X 1.11

+30% KOH 1.5ml

五、实验现象与结果讨论

●糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。

●糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，但与碘试剂原来颜色区别不大。

●鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色，下层无色。