肝糖原的提取与鉴定实验报告

肝糖原的提取与鉴定实验报告

实验六肝糖原的提取

实验六肝糖原的提取、鉴定与定量

（生物化学实验操作考核卷）

姓名，学号，专业，级班组，月日

目的要求:

1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。

5. 正确掌握溶液转移的操作。

6. 正确操作使用分光光度计。

实验原理:

糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶

且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95, 乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

CuSO 什 2NaOH ? Na2 SO4+Cu(OH)2?

2Cu(OH)2十 C6H12O6 ? 2CuO 十氧化型葡萄糖 +H2O

2CuOH ? Cu2O?红色)+H2O

Cu(OH)

CuO?(黑色)+H2O

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生 物—— 5-

羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质 在620nm 处有最大吸收。糖含量在（10?100）?g 范围内，溶液颜色的深浅与

可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比 色，通过标准

对照法 （直接比较法 ）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液

中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留 肝糖原。

实验材料 :

（ 一 ） 仪器

1. 普通离心机，室温？100?恒温水浴箱（X 2） , 722型分光光度计，精度为 10mg 级电

子天平（X 1）

试管架（X 1），10mL 离心管（X 2），（100 X 15）mm 试管（X 6）

刻度吸量管（2mL X 1，5 mL X 2），1000^L 微量可调取液器（X 1）

5. 100mL 容量瓶(X 1)

6. 白瓷反应板 （X 1）

（ 二） 实验样品和试剂

1. 鸡肝。

2. 95, 乙醇。

3. 0.31mol/L(5,) 三氯醋酸溶液 :称

2. 剪刀（X 1），镊子（X 1），研钵（X 1）

3. 4.

取未潮解的三氯醋酸(C2HCl3O2，163.39)5g ，加蒸馏水溶解至100 mL。

4. 0.15mol/L NaCl 溶液:称取8.8g NaCl 加蒸馏水溶解至1000 mL。

5. 12mol/L HCI: 浓HCI 原液(36%?38%)

6. 12.5mol/L(50,)NaOH: 称取NaOH 50g 用蒸馏水溶解至lOOmL

7. 碘试剂：碘lOOmg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中。

8. 班氏试剂: 称取柠檬酸钠

(C5H5Na3O7?5H2O294.10)173g 和无水碳酸钠(Na2C03，105.99)100g 溶于蒸馏水800mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3,硫酸铜(CuSO4?5H2O249.68) l00mL,边加边摇。再加蒸馏水至1000mL混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可

长期保存。

9. 5.35mol/L(30,)KOH 溶液：称取KOH 30g加蒸馏水溶解至100 mL。

11. 标准葡萄糖液(50mg/L):称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg加蒸馏水溶

解至500 mL。

12. 17mol/L(90,)H2SO4:量取蒸馏水30mL 加浓H2SO4500 m。

13. 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂

不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4?5 天。

实验方法:

吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量

管。

( 一) 肝糖原的提取与鉴定操作流程如下。

鸡肝约1 g ，剪碎

，5%CCl3COOH 1 ml

5%CCl3COOH 3 ml

研磨成肝匀浆

3分钟(4000 r / min)

，5 ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟

4000 r / min)

上清（弃去）

沉淀

，蒸镏水2 ml

鉴定方法?

1ml

，浓HCl 0.2mL

0.1mL(2 滴)

，班氏试剂0.2mL（4 滴）

混匀

沸水浴2

注意事项

1. 肝糖原提取一步，向上清液中加入5mL95乙醇后，务必注意混匀。由于上

清液为水溶液，比重大于95,乙醇，溶液分成两层。加之上清液已3mL多，总量接

近9mL混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀, 或用玻璃棒搅拌混匀。

2. 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20 个以下的会使碘呈现红色，20?30个之间使碘呈现紫色，60 个以上的

会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在

20 个以下（通常8?12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。

3. 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑