激光共聚焦显微镜校准规范 编制说明
激光共聚焦扫描显微镜管理规定
激光共聚焦扫描显微镜管理规定上海巴斯德所激光共聚焦显微镜属研究所公用精细仪器。
该设施的使用操作，除恪守《中国科学院上海巴斯德研究所公用仪器管理方法》各项规定外，还需恪守以下要求：一、使用资格认证制度研究所指定技术支撑部仪器特意管理人员管理该仪器的平时管理并负责操作。
使用者须经过预先培训并由仪器管理人员查核，考试合格者获取使用资格。
二、实验预定制度1.拟使用本仪器人员，须提早 2 天申请预定（须照实填写电子版预定单 , 发送邮件至hxgao@，经仪器管理人员赞同并联系预定人署名，为达成预定）。
撤消预定, 提早起码 24 小时发出邮件至hxgao@说明原由。
2.实验时间原则上安排在正常工作时间以内（ 9:00_5:30, 周一_ 周五），由仪器管理人员依据工作日程确立实验时间。
3.外单位申请使用，一定经过仪器管理人办理审查手序。
4.计时收费由预定时间开始计时，30分钟内还未出席使用，或未按要求撤消预定的，按30分钟收费，管理人员应实时安排其余人实验，并依照仪器使用规章对预定人做相应办理。
三、标本准备要求及仪器使用规定1.实验标本制备、实验内容应切合研究所生物安全、同位素使用安全、化学品安全及其余有关规定。
违犯者撤消使用资格，并视详细状况追查有关人员法律责任。
2.本仪器系统仅用于无感染活性、完好固定的制备标本察看剖析。
封片建议使用抗荧光淬灭的专用封片剂。
3.实验人负责标本制备及其余准备工作。
4.实验要求：准时进行实验，免得仪器空转；每次实验的实验者请不要超出 2人；禁止任意变动仪器设置，激光器的开、关，物镜的安装由管理人员达成；实验时期没关人员不要任意进入实验室。
5.实验异样状况办理：发现仪器任何异样状况请马上联系管理人员。
发生盖玻片、载玻片破碎等状况，实质操作者将肩负物镜改换花费，并视详细状况按照研究所有关规定进行办理。
为防止事故发生，实验者应要务实验时管理人员在场。
6.实验结束：由管理人员依照操作规程封闭激光器、洁净物镜。
激光共聚焦显微镜校准规范
，JJF XXX-2019激光共聚焦显微镜校准规范(征求意见稿) Calibration Specification for Laser Confocal Microscope激光共聚焦显微镜校准规范Array Calibration specification forLaser confocal microscope归口单位：全国几何量长度计量技术委员会主要起草单位：参加起草单位：本规范主要起草人：参加起草人：目录引言 (II)1范围 (1)2引用文件 (1)3术语和定义 (1)3.1激光共聚焦显微镜 (1)3.2标准样板 (1)4概述 (1)5计量特性 (2)5.1畸变 (2)5.2水平方向测量示值误差 (2)5.3垂直方向测量示值误差 (2)5.4 测量重复性 (2)5.5 水平方向正交性误差 (2)5.6 最大可测倾斜 (2)6校准条件 (2)6.1环境条件 (2)6.2测量标准 (2)7校准项目和校准方法 (3)7.1畸变 (3)7.2水平方向测量示值误差 (4)7.3垂直方向测量示值误差 (5)7.4测量重复性 (6)7.5水平方向正交性误差 (6)7.6最大可测倾斜 (6)8校准结果表达 (7)9复校时间间隔 (7)附录 A 激光共聚焦显微镜测量示值误差的不确定度评定 (8)引言本规范针对激光共聚焦显微镜校准。
制定本规范的目的主要是解决激光共聚焦显微镜在长度测量应用中的校准问题。
本规范的主要参考标准是Geometrical product specifications(GPS) – Surface texture: Areal Part 607: Nominal characteristics of non-contact(confocal microscopy) instruments（产品几何技术规格（GPS）–表面纹理：区域第607部分：非接触式（共聚焦显微镜）仪器的标称特性）。
激光共聚焦显微镜操作指南说明书
激光共聚焦显微镜操作指南说明书激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率、高对比度的显微镜，广泛应用于生物医学研究、材料科学等领域。
本操作指南将详细介绍激光共聚焦显微镜的操作流程和基本操作技巧，帮助用户正确、高效地使用该设备。
一、设备准备在开始使用激光共聚焦显微镜前，需要进行以下设备准备：1. 检查电源线和数据线是否连接正常，确保设备供电和数据传输正常；2. 检查激光源是否正常工作，激光功率是否稳定；3. 检查镜头和滤光片是否清洁，清除灰尘和污渍，确保成像质量；4. 准备适当的标本样品，并将其固定在载玻片上。
二、系统启动1. 确保设备处于待机状态，按下电源按钮，等待系统启动；2. 检查系统软件是否正常运行，若出现异常情况，及时联系维修人员进行处理；3. 检查镜头和滤光片的安装是否正确，确保成像时的光路通畅；4. 开启激光源，根据需要选择合适的激光波长和功率；5. 调节扫描镜和物镜的位置，使光线准确聚焦在样品上。
三、图像获取1. 打开激光共聚焦显微镜软件，并根据需要选择合适的成像模式；2. 调节激光功率和增益，确保图像的亮度和对比度适宜；3. 调节扫描镜的扫描速度，根据样品的要求选择合适的扫描速度；4. 调节焦距和聚焦位置，通过手动或自动对焦功能获取清晰的图像；5. 点击图像捕捉按钮，记录当前图像或录制图像序列。
四、图像处理和分析1. 通过激光共聚焦显微镜软件提供的图像处理功能，对图像进行调整和增强，以获得更好的观察效果；2. 根据需要，利用软件提供的计算和分析功能对图像进行进一步处理，如三维重建、光学切片等；3. 对图像进行定量分析时，选择合适的工具和算法，并按照要求设定参数；4. 记录和保存处理后的图像数据，以备后续分析和报告撰写使用。
五、设备关闭1. 停止图像采集和处理工作；2. 降低激光功率，关闭激光源；3. 将扫描镜和物镜返回初始位置，关闭设备；4. 断开电源和数据线，保持设备清洁干燥。
Leica Stellaris 5 激光扫描共聚焦显微镜使用说明书
Pod A:Leica Stellaris5Laser Scanning Confocal MicroscopeKyle Marchuk Austin Edwards Mohammad Naser Harrison WismerMay2023Contents1Introduction2 2Start-Up2 3Focusing Your Sample3 4Initial Image Setup64.1Dye Assistant (6)4.2Manually Creating Sequences (7)4.3Optimizing the Fluorescence Signals (7)5Imaging Parameters85.1XY Tab (8)6Imaging Modules96.1Z-Stack (9)6.2Navigator (10)7Saving Acquired Images12 8Other Imaging Tips128.1Project Naming and Saving (12)8.2USB Control Panel (13)8.3Fast Live Settings (13)9Shut Down141IntroductionThe Leica Stellaris5is an inverted laser scanning confocal with4laser lines(405nm,488nm,561nm,and638 nm).It features3next-generation Hybrid Detectors(HyDs).All new users need to be trained by a BIDC staff member before independent use.Sign up for time using the iLab microscope scheduler.The objectives available for use on the Stellaris5are:Objective Mag NumericalAperture Immersion WorkingDistanceID NumberHC PL Fluotar5x0.15Air13.7mm506224 HC PL APO CS220x0.75Air0.62mm506517 HC Fluotar VISIR25x0.95Water 2.40mm506375 HC PL APO CS240x 1.30Oil0.24mm506358 HC PL APO63x 1.40Oil0.14mm506350 2Start-Up1.Turn On the two power switches on the left side of the microscope control box.See Figure:1.NOTE:The key should always be On and the microscope power box should always be On.Figure1:The power supply switches located to the left of the computer desk.2.Turn On the computer tower.3.Log into the User account.unch the LAS X software from the desktop.5.Confirm that the machine configuration and the DMI8microscope are selected at the first prompt.SeeTop Figure:2.6.Ensure the stage area is clear of obstructions and Initialize the stage in the second prompt.See BottomFigure:2.Figure2:The two prompts to launch the software.3Focusing Your Sample1.Select your objective in the software(See Top Figure: 3.)or on the front panel of the microscope(SeeBottom Figure:3.).Figure3:Options for selecting the objectives.2.Add an immersion media to the objective if needed.3.Place your sample into the appropriate sample holder.4.Add the sample holder to the stage.e the xy-stage controller to align the sample above the objective.6.On the front of the microscope navigate to the filter panel menu.See Red square Figure:4.7.Select FLUO for the Incident light.See Blue square Figure:4.8.Press the IL-Shutter to shine light on the sample.See Green square Figure:4.9.Slowly raise the objective using the z-control until your sample comes into focus.Figure4:Widefield illumination panel.4Initial Image Setup4.1Dye AssistantFigure5:Dye Assistant Interface.The Dye Assistant is a useful tool to quickly generate acquisition sequences for multiple fluorophores.The software can optimize for speed of acquisition or minimal fluorescence bleedthrough between channels.1.Click on the Dye Assistant Icon near the top-middle of the main screen.See...2.Press the’...’Icon and search for your fluorophore.3.Continue until all fluorophores are added.4.Apply one of the proposed sequences.None Sequential:All channels will be acquired simultaneously.This is the fastest option,but it is limited to3channels.This will likely have the most Crosstalk of the suggested settings.Line Sequential:Switches Sequences each line of the images scanned.To maximize speed,Channels that share a Detector need to have the same Bandpass width.Frame Sequential:Switches Sequences at the end of each image plane.No limitation on the width of the Bandpass window.Switching the hardware this way increases time.Stack Sequential:Switches Sequences at the end of each Stack.Considerably faster than Frame Se-quential and no limitation on Bandpass width.5.Once a sequence in the Dye Assistant has been selected,the program will ask if you want to turn on thelasers needed for imaging.Select Yes.6.Ensure the microscope arm is in place prior to going Live.4.2Manually Creating SequencesFigure6:Sequence Interface.1.Press the’+’Icon to add the number of Sequences you would like.2.Search for a fluorophore in the Search Bar.3.Drag the fluorophore Icon down to the Sequence you want to place it in.4.Continue adding all your fluorophores to the Sequences.5.Choose whether you want Line Sequential,Frame Sequential,or Stack Sequential by choosing theappropriate Icon(see above).6.When you are happy with your Sequence you can Save it to your directory by pressing the Down ArrowIcon.4.3Optimizing the Fluorescence SignalsFigure7:Tools to quickly optimize your image intensity.1.Click Live or Fast Live in the lower-left of the screen to start imaging the selected Sequence.2.Ensure the sample is in the imaging plane by adjusting the Z-position using the dial on the smart panel.You may need to adjust the Look up Table(LUT)slider to see signal.3.Select the Over/Under Saturation display for the live images.4.Click on a displayed image to select that channel for gain adjustment.5.Adjust the laser power and gain until you have a bright image just below saturation(blue pixels).6.Click on the Capture Image button to collect and save an image of that Sequence.7.Click on the Start button to collect and save an image of all Sequences.5Imaging ParametersAfter setting up the laser and gain acquisition settings for the sequences,the user can set up the rest of sample acquisition parameters.5.1XY TabFigure8:XY TabIn general,used for setting up XY parameters pertaining to how images are captured.Format:The size of the image in pixels.Suggested size is1024x1024for most applications.Speed:Image acquisition speed.Suggested speed is600Hz.Speed faster than600Hz will require increasing the Zoom of the image.Bidirectional X:Data is collected on both movement directions of the X galvo.Some acquisition parameters are tied to this setting.Zoom Factor:Digital Zoom of the image.Increasing the magnification of the objective will give a better image and optical section capability.Zoom In:Press this button to draw an ROI on the image.The microscope will zoom on the ROI.Image Size:Describes the size of the image in microns.This is dependent on the Objective,Format,and Zoom Factor.Pixel Size:Describes the size of the pixel in microns.Optical Section:Thickness of the image plane.Pixel Dwell Time:Length of data collection for each pixel.Frame Rate:Time required to collect a single sequence at a given image plane.Line Average:Number of times each line of the image will be acquired and averaged to produce the image.Used to reduce noise.Line Accu:Number of times each line is accumulated(summed)to produce and image.Can be used on very dim samples.Frame Average:Number of times each frame of the image will be acquired and averaged to produce the ed to reduce noise.Frame Accu:Number of times each frame is accumulated(summed)to produce and image.Can be used on very dim samples.Auto Gain:The system will increase the gain to optimize the image with the current laser power.Rotation:Rotation of the image.Pinhole:Used to adjust the pinhole size.Increasing the pinhole produces a brighter signal at the expense of your optical section capability.6Imaging Modules6.1Z-StackFigure9:Available settings for the volume acquistion.Used for creating the volumes of a3D stacked image.Begin:Using the Z-Position knob,move the image plan to the Top of your sample and press this button to assign this position.End:Using the Z-Position knob,move the image plan to the Bottom of your sample and press this button to assign this position.Trash Can Icon:Deletes your position assignments.Stack Direction(Z):Scanning direction for the volume acquisition.Typically,you want to move the stage toward the objective to scan into your sample.Number of Steps:Volume divided by Z-Step Size.Z-Step Size:Volume divided by Number of Steps.System Optimized:Determined by the objective;the smallest Z-Step Size before over-sampling the volume. Z-Compensation:Is used to associate laser power and gain with z-position.Typically,it is used to compensate for scattering in a thick sample.1.Check which options you’d like to associate with z-position.Excitation Gain is laser intensity.Emis-sion Gain is the HyD gain.2.Navigate to an imaging plan within your volume and adjust the laser intensity and HyD gain to yoursatisfaction.3.Move to other planes and repeat the process.4.Delete any positions you do not need or may have loaded when you started.5.Select your next Sequence and repeat the process.Travel Range:Full distance the z-stage can travel.6.2NavigatorThe Navigator Module is a large-area exploration tool that is capable of setting up multiple ROIs of different sizes for tiled-image acquisition.The navigator can be opened by clicking the grid icon in the top left corner of the main LAS X window.Figure10:Navigator IconOnce open,you should see a white box on a gray background.This box represents the current field of view of the stage.When opening the navigator for the first time,this box will be located at last field of view seen in the main software window.Beam Path Tab On the Stellaris,individual settings can be temporarily turned on and off by checking and unchecking the box in the top left corner of each setting in the Beam Path tab.Having less settings active when spiraling will greatly increase the tile it takes to create a tiled preview.Moving the Stage:Double-click on the viewing area and the stage will move and take a preview tile using the currently selected sequence.Live:Press the Live button to continuously view the current stage position depicted by the white box.Fast Live:Press the Fast Live button to continuously view that stage position in a lower resolution(faster than Live).Spiral Press the Spiral button to engage the stage in an expanding pattern for exploration.ROIs Using the ROI shape tools,draw ROIs on the stage area for exploration or experiment acquisition.Figure11:ROI&Focus Map tools located at the bottom-center of the screenPreview Press Preview and the microscope will do a fast acquisition of the drawn ROIs.Start Press Start to run the experiment from the Navigator.Any ROIs created for tiling will be listed in the tab in the bottom right of the screen.Shapes can be either deleted or temporarily turned off using this tab.Figure12:List of all created ROI shapes to be imaged.Focus Map For uneven tissues,individual focus points can be manually placed and each associated with a unique Z position in order to correct for the uneveness of the sample.1.Select either the blue focus point or green auto-focus point from the options next to the ROI tools.See Figure11.2.The Focus Map option will now be illuminated.Select Focus Map,and click on the first focus pointlisted.3.The software will zoom in on a live view of the field of view surrounding the selected focus point.Adjust the Z position until the sample is in the desired focal plane.4.Once satisfied,select Set Z to associate the focus point with the current Z position.5.Hit Next.Then repeat steps3-5for each focus point placed.Figure13:Focus Map Tab7Saving Acquired Images1.Click the Experiments tab to view all images taken.2.Delete or Rename images as needed.3.Click Save All to save images as a.lif file to your hard drive.4.Please remove old files from the Stellaris computer once they have been saved on your hard drive or Box. 8Other Imaging Tips8.1Project Naming and SavingIt is important to adopt a project naming and saving convention to avoid future headaches when trying to analyze the data.1.Save your Project file with a name that identifies the experiment.We recommend this to be either a slideidentifier or an experiment identifier with a date.2.Rename the images within the Project file with descriptions of the image type.We recommend makingnote of whether the images are z-stack,tiles,timelapse,etc.This will make it easier to’unpack’the imageslater.8.2USB Control PanelFigure14:Can be customized for your workflow.The USB Control Panel can be customized to include controls you may want to readily access.For example, the xy stage position can be controlled similarly to the z-piezo.To add additional features:1.Press the USB Panel shortcut button.2.Select a dropdown and change it to x Position(Stage).3.Select another dropdown and change it to y Position(Stage).To change the speed at which the z-stage moves:1.Located below the Z-Position dropdown(far right):2.Select the speed you wish the stage to move per full turn of the wheel on the USB bar.8.3Fast Live SettingsFigure15:Interface for the Fast Live settings.Pressing the Fast Live’gear’icon allows you to change the XY imaging settings while in Fast Live.The BIDC recommends256x256at600Hz with Bi-Directional scanning On.9Shut Down1.After saving,close the LAS X software.2.Shut down the computer using Shut Down option in the Start Menu.3.Remove samples and clean objectives as needed.4.Press the two Power Switches to turn off the entire system.5.Replace dust cover and clean the area.Contact the BIDCThe BIDC office is located in Medical Sciences Building Room S1109.The BIDC office phone number is415-476-4550.If you need immediate assistance and no one is available in the office,or it is after business hours,please call the BIDC Hotline at415-745-2432.。
激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser sea nning con focal microscope)，英文简写LSCM，俗称con focal。
LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。
我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。
使用流程1、登陆或5号楼606室公用电脑下载?激光共聚焦预约使用审核表?，打印并填写。
2、联系卢剑清(手机：)审核并签名。
3、持已签名的?激光共聚焦预约使用审核表? 至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞(手机：。
4、在熟练使用者的指导下，进行实验。
5、实验结束，及时归还钥匙。
仪器构造和原理LSCM的根本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。
激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源，普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度、相干性好等优点,可以防止普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar)、氪(Kr)、氦(He)、氖(Ne)。
illu min ati ng pin hole (照明针孔)：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后，通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描，Focal plane (焦平面)：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
OLYMPUS激光共聚焦显微镜说明0906
2， 技术特点 同类产品相比有如下技术特点和优势： 1）光学最小分辨为 0.12um,有实例为证。
2）测量的重复性为：3n-1=0.02um, 在同类产品中精度最高。 3）测量数据有权威机构认证，OLS4000 测量精度是由日本品质保证机构严格的追溯体系来 保证，可以提供高可靠性的测试数据。
1
4）光学放大倍数范围：108X---17280X, 108 倍：更宽的视野，可迅速找到测试部位； 17280 倍：突破光学显微镜的放大极限； 5）20X/50X/100X 物镜档次采用显微镜中最高档的―――平场复消色差物镜，
数值孔径（分辨率最高）最大，可以观察更大角度的斜面。
6） 迅速找到测试部位：在操作界面可轻松控制的 100 X 100mm 电动载物台，大画面高倍清 晰图像，小画面低倍宽视野定位图像，即使是在高倍观察时也不会迷路。
2
7） 便于操作，降低污染或破坏样品可能性的 6 孔电动物镜转盘
8） 多样化的观察方式 明场，明场微分干涉，激光共焦，激光共焦微分干涉
3
9） 可以克服同一画面内有不同反射率的双共焦光学系统
双共焦系统
10）
INR（智能降噪Biblioteka 演算方式11）内置减振机构，再不用配笨重的防振台
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3， 检测内容 1）高分辨率二维形态观察，真实色 2 维观察； 2）高分辨率三维形貌观察，真彩三维形貌观察， 3）高精度测量：线宽，高度测量，线粗糙度，面粗糙度，面积，体积测量，几何测量，直 径/半径测量，圆周长，颗粒分析，膜厚测量等。
OLYMPUS 激光共聚焦显微镜-OLS4000
1， 主要性能指标
激光光源 物镜 光学放大倍率 观察范围 载物台 二维分辨率 Z 轴最小移动分辨率 X 轴方向测量重复精度 Z 轴方向测量重复精度 半导体激光器 (λ = 405 nm ) 5X / 10X 为 半复消色差物镜 20X / 50X / 100X 为 LEXT 专用复消色差物镜 108X-17280X 128X128 微米-2560X2560 微米 100X100mm 超声波电动载物台 0.12 m 0.01 m (光栅尺刻度为 0.0008 m) 3n-1=0.02 m (条件为使用 MPlanApo100 物镜) =0.012 m。 (条件为使用 MPlanApo100 物镜) 日本工业安全标准 2 级
激光共聚焦扫描显微镜操作规程
激光共聚焦扫描显微镜操作规程一．开机程序1．开启总电源，确认所有仪器电源状态正常工作2．开启电脑，双击桌面上的LSM510图标，开启显微镜。
3．在初始平面上点击Start Expert Mode 键开启专家拍摄模式。
4．在主菜单中点击File New键，建立新的数据库。
二．软件拍摄1．在主菜单上点击Acquire Laser键，开启需要使用的激光2．在主菜单上点击VIS键，开启显微镜观察模式3．把需要观察的玻片放到载物台上选择需要观察的平面4．在主菜单上点击LSM键，开启进入显微镜激光扫描模式5．在主菜单上点击Config键，选择所需要扫描的模式及参数6．在主菜单上点击Scan Find键，进行图像参数自动校正7．在Scan子菜单下点击Fast X键，进行层面选择8．在连续扫描中调节放大器增益、补偿；激光强度等图像参数来优化图像9．点击图像子菜单上的Save键存储优化好的图像三．关机程序1．完成所有操作后，关掉激光开关，冷却5分钟后，点击主菜单上Exit键，退出所有程序2．关闭电脑3．关闭电源ZEISS 510 MET A二维扫描程序1.在Acquire → config →确定扫描所需的波长，（如果已作过相同方法的扫描，可直接调出一张相同条件的图像，用图像窗中的Reuse确定有关的扫描条件）2.在Acquire → micro →在低倍镜(透射光或荧光)下找到要观察的图像3.在Scan control → mode → find →在显示器上找到图像，选定扫描需用的分辨率4.调节物镜到适当的放大倍数5.Scan control → mode →New，打开一新图像窗6.在Scan control → mode → cont →用zoom将图像大小调至最佳，用Pinhole（一般选1）、Detector Gain（650左右，不宜时间超过800，也不宜低于500）、Amplifier offset（不宜过低），以及选择作算术平均值次数、调节激光强度（488nm不超过25%）等调节图像质量至最佳。
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准在现代科学研究中，激光共聚焦拉曼显微镜（以下简称激光拉曼显微镜）已经成为一种常用的分析工具。
激光拉曼显微镜通过激发样品中的化学键振动，可以获得关于样品成分、结构和性质的信息，具有高灵敏度和高分辨率的特点。
然而，由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准显得尤为重要。
1. 激光拉曼技术的基本原理激光拉曼技术是一种非破坏性的光谱分析方法，通过使用激光和光谱仪来探测样品的分子振动信息。
当激光与样品相互作用时，部分光子被散射，而其余光子则会发生拉曼散射，从而获得特定频率的振动能级信息。
激光拉曼显微镜结合了共聚焦技术，可以实现光学显微镜和拉曼光谱仪的双重功能，不仅能够获得高分辨率的成像，还可以获得高灵敏度的拉曼光谱信息。
2. 制定激光拉曼显微镜检测标准的重要性由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准变得至关重要。
标准化的检测流程和方法可以保证实验数据的可靠性和准确性，同时也有利于不同实验室和研究机构之间的结果比对和交流。
制定检测标准还可以促进技术的进步和应用的普及，推动激光拉曼技术在不同领域的应用。
3. 激光拉曼显微镜检测标准的制定内容激光拉曼显微镜检测标准应包括样品制备、仪器校准、数据采集和分析等多个方面。
在样品制备方面，应该明确样品的准备方法、存放条件和处理步骤，以确保实验的可重复性和可比性。
仪器校准也是非常重要的环节，需要制定相应的校准方法和标准物质，以保证激光拉曼仪器的准确性和稳定性。
对于数据采集和分析，应该规定数据的采集参数、处理方法和结果解释的标准流程，以确保实验结果的可靠性和准确性。
4. 个人观点和总结在我看来，制定激光拉曼显微镜检测标准是非常必要的，可以保证激光拉曼技术在科研领域的可靠性和准确性。
我认为，在制定标准的过程中，应该充分考虑实际应用的需求和特点，同时也应该借鉴国际标准和先进经验，以期制定出通用、实用和可操作的检测标准。
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准的制定对于推动该技术在不同领域的应用具有重要意义。
激光扫描共聚焦显微镜使用说明
激光扫描共聚焦显微镜使用说明标签：激光扫描共聚焦显微镜使用说明激光扫描共聚焦显微镜可以：（1）光切片扫描、3D图像处理、时间序列拍摄成像；（2）细胞、绿荧光蛋白、生物荧光样品观察分析；（3）荧光原位杂交分析。
详细实验方法共聚焦显微镜激光扫描法实验方法原理激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
实验材料细胞试剂、试剂盒荧光染料水培养基仪器、耗材激光扫描共聚焦显微镜载玻片洗瓶滴管试管实验步骤一、观察及仪器操作1. 开启仪器电源及光源一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。
以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。
使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
2. 设置相应的扫描方式在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。
切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。
3. 获取图像选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。
4. 关闭仪器仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。
若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
二、获取三维图像激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。
Leica SP5 II激光扫描共聚焦显微镜使用说明书
Set up acquistion parameters and acquire an image1. Beam Path Settings in the central Work area: there are 3 ways toconfigure excitation and emission parametersA. use a preseti. click on Load/Save single settingii. select a Leica or User Settings (for multichannels, thedefault is simultaneous scan, see below for sequentialscan)B. reuse a setting from a previous scani. open a previous experimentii. in the Experiments tab, click to select the desirablescaniii. right-click to choose Apply Setting or hit Apply buttonat the bottomC. assemble from scratchi. set laser poweractivate the shutterset power level of the desirablelaser line, 5 % is a good startingpointii. select the beam splitter (dichroic)selections for different laser linesbeam splitter\laser line (nm)RT 30/70 for backscatter or reflectionSubstrateTD 488/561/633DD 458/514RSP 500DD 488/561spectra or details for the beam splitters are in the Appendix405✓✓458✓✓✓476✓✓✓✓488✓✓✓✓514✓✓561✓✓✓633✓✓iii. setup the detectorselect the emission band: drag the lower and upper bounds or double click the slider to enter the begin and end wavelengthsCaution : Drag the sliders slowly or else they will jam!click on PMT n to adjust PMT Gain* and Offset*; good starting values are 800 and 0,respectivelyselect a LUT as default activate the PMT2. select the Acquire Operating step on top left, click the Acquisition tab to set up the data formatA. Acquisition mode paneldefaults to xyz simultaneous scan seq. button enables sequential scan Tile scan, and Mark and Find Best Focustop left side of the viewer display Window: activate the Glow (OU) LUT via the Quick LUT button which cycles through the default , Glow (OU) , and grey LUTsii. adjust offset so the pixels in the area you think should be darkest just turn green,click the button on Acquistion Mode on the upper left to open the Sequential Scan panelclick to toggle displaying the Tile Scan windowgo Livemove the prep/stage to the left boundary of the region of interest, focusclick to mark the current positionrepeat the last 2 steps for the top, right, and bottom boundries, the software will calculate theMark and Findclick to toggle displaying the Mark and Find windowif there are existing coordinates, you can save or clear them firstmove the prep/stage to the desirable area and focus on the object of interestclick to mark the current position, which will be listed as positionNrepeat the above 2 steps to mark more positions as needed, i.e., positionN+1, N+2... etc.you can go back to any position by selecting it from the drop down listAppendixContentDMI 6000 inverted microscope: basic controls • modes of operation • using immersion objectives beam splitter spectra • working with lif files • scannersoft ware ov erv iew and layoutLAS AF user int erfaceDMI 6000 inv ert ed microscopeCont rolsfocus knob on either side of microscope (z-Wide)commonly used functions are controlled by 5 sets of buttons1. left rear variable function buttonsCHG TL ◑: switch to transmitted light, TL and rotate through different modes TL_BF(bright field), _DIC, _POL (polarization)CHANGE CS: toggle between confocal SCAN and the last selected TL modeCOMBI ◑: epifluorescent + DICZ COARSE Z FINE: toggle z control2. left front: Illumination ManagerTL/IL: toggle between TL and IL(incident-light i.e., epifluorescence)AP: aperture diaphragm for TLINT : light intensity, press both togetherto toggle between Coarse and Fine modeFD: field diaphragm for IL3. fronttop row switches should not be activated,or else it may block viewing through thebinocular, to rectifypress the leftmost button to selectbinocularpress the rightmost button todeselect the supplementalmagnification changerSHUTTER: for epifluorescentilluminationbottom 6 buttons: for selecting specific cube (DAPI, GFP, DsRed) for epifluorescence;press the middle 2 buttons together to display the programs assigned to the variablefunction buttons4. right rear variable function buttonsCHGOBJ ↻: rotates the objective turret oneposition clockwise in the current mode (dry orimmersion)CHGOBJ ↺: same as above butcounterclockwiseDRY/IMM: toggles between dry and immersionmode5. right front: Focus buttonsZ ↑: moves the Z drive up when a upper focus stop hasbeen setZ ↓: moves the Z drive downSET + Z ↑: toggles set and unset upper focus stopSET + Z ↓: toggles set and unset lower focus stopSmartMove remote control for stage movements, as observed in theviewer display window of the software1. X2. Y3. Z (focus, z-wide)4. left button set selects Precise or Fast XY movement5. right button set selects FINE or COARSE focus controlfront LCD panel displays the current status1. Contrasting method e.g., TL, FLUO, orSCAN; and IL SHUTTER status2. Objective lens and Magnification, see fronttop buttons above3. Illumination and Apertures4. Camera Ports/Eyepieces, see front topbuttons above5. Focus controlNote:display on the right shows z at0 µm with upper focus stop set andlower focus stop unsetif upper focus stop is unset, display will indicate --.-- mm andindicates lower focus stop is setModes of operat ionTL1. press CHG TL ◑ to rotatethrough BF, DIC, and POL2. adjust intensity (INT) andaperture (AP) as needed3. optional, press CHG CS toscan mode thus shutofftransmitted light4. a knurled wheel (arrowhead)on the left side below theobjective turret adjusts theDIC shear; it's a rather tightspace!IL/epifluorescence1. turn on FLUO (fluorescent light source)2. press the button for the desirable cube, see the front buttons in Controls3. press Shutter to illuminate specimen4. adjust the intensity (INT) and field diaphragm (FD) as needed5. press Shutter to block illumination when done viewinglocate the area of interest with a dry objective and focusclick to bring up the Mark and Find interfaceclick to record the current position: positionNpress and hold Z ↓ to lower the turret completelyobjective to focusclick to dismiss the Mark and Find interface manual (not recommended)TD 488/561/633DD 458/514 is similar to the TD 458/514/594shown hereDD 488/561beam split t er spect raRT 30/70 is 30% reflection and 70% transmissionSubstrate is just plain glass (50/50)RSP 500 is a 500 nm long pass filterTD and DD are triple and double dichroics (transmission bands in blue)working wit h lif fileuse ImageJ and Bio-Formats plugins, see details on using ImageJuse the free Leica LAS AF Lite application from Leica's ftp depository , Windows only scannerdwell time at several common scan speed settingsline frequency (Hz)horizontal scan duration (s)dwell time (µs)max min100.184.949.71000.018.5 5.04000.025 2.1 1.26000.0017 1.40.810000.0010.90.5。
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 说明书
德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作制作：：Zeiss 光学仪器光学仪器（（上海上海））国际贸易有限公司 孙 凯2009年6月目录目录：：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片实物照片说明说明 2 系统的使用2.1 开机顺序2.2 软件的软件的快速快速快速使用使用使用说明说明2.3 显微镜显微镜的的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：：电动荧光显微镜电动荧光显微镜、、扫描检测单元扫描检测单元、、激光器激光器、、电脑工作站及各相关附件组成电脑工作站及各相关附件组成。
系统系统组成及光路组成及光路组成及光路示意图示意图示意图：：电脑工作站 激光器扫描检测单元电动荧光显微镜实物照片说明实物照片说明：：电动荧光显微镜扫描检测单元CO 2培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序（1）打开稳压电源打开稳压电源（（绿色按钮绿色按钮））等待2分钟（电压稳定）后，再开其它开关（2）主开关 [ MAIN SWITCH ]“ON ”电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON ”扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“ON ”（3）打开 [ 电动显微镜开关 ]打开 [ 荧光灯开关 ]（注：具有5档光强调节旋钮）（4）Ar 离子激光器离子激光器主开关主开关 “ON ”顺时针旋转钥匙 至 “—”预热预热等待约等待约15分钟分钟，，将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby ”扳至“Laser run ”状态状态，，即可正常使用（5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统注：键盘上也具有 [ 电脑开关 ]2.2 软件的快速使用说明（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：“Start System ”————初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书[激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书]引言：本操作指南为用户提供激光扫描共聚焦显微镜的详细操作流程及相关注意事项。
在使用本设备之前，请仔细阅读本指南，以确保能够正确、安全地操作设备，并获得最佳的成像效果。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的显微镜技术，结合了共聚焦成像和激光扫描技术，可以实现高分辨率、三维成像及活细胞观察等功能。
本设备由以下主要部分组成：1. 共聚焦显微镜主体：包括光源系统、光学系统、扫描系统、探测器等核心部件。
请勿对主体进行任何未经授权的拆卸或修改。
2. 控制系统：用于控制设备的开关、成像参数设置、图像采集及处理等功能。
在操作设备之前，请确保控制系统处于正常工作状态。
二、准备工作在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请进行以下准备工作：1. 检查设备：确保设备的电源线、信号线、光纤等连接线路良好，无损坏或松动情况。
2. 准备标本：根据需要观察的样本类型，准备适当的标本片，并在标本片上施加适当的荧光染料。
3. 调整镜片：根据需要选择适当的镜头，并按照设备说明进行安装和调整。
三、操作步骤以下为基本的操作流程，具体步骤可能会因设备型号和厂家而有所不同，请根据实际情况进行操作：1. 打开设备电源：将电源开关置于“开启”位置，待设备启动完全后，检查设备各部分是否正常。
2. 设置成像参数：通过控制系统，设置激光波长、放大倍数、成像模式等参数。
根据标本类型及观察需求，合理选择参数设置。
3. 校准镜片：根据设备说明书，进行扫描头和标本之间的焦距调整，保证成像过程中的清晰度和准确度。
4. 开启激光：根据标本需要，选择相应的激光波长，并逐一打开相应激光。
5. 定位标本：通过显微镜目镜进行初步观察，调整位置和焦距，使标本位于成像区域。
6. 开始扫描成像：在控制系统中选择扫描图像模式，点击“开始扫描”按钮，启动扫描成像过程。
7. 图像采集和处理：根据需要，可设置图像采集的帧数、分辨率等参数，并在采集图像后进行必要的图像处理和分析。
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书操作说明书激光扫描共聚焦显微镜是一种高端的显微镜设备，具有高分辨率、高灵敏度的特点，广泛用于生物学、医学、材料科学等领域。
为了正确且有效地操作激光扫描共聚焦显微镜，本操作说明书将为您提供详细的指导。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜由以下主要部分组成：1. 显微镜主体：负责接收样本的光信号，并进行扫描成像。
2. 激光系统：提供高能量、高稳定性的激光光源，用于激发样本的荧光信号。
3. 探测系统：用于接收样本的荧光信号，并将其转化为图像信号。
4. 控制系统：提供对显微镜参数进行调节和设置的功能。
二、注意事项在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请确保您已熟悉以下注意事项：1. 安全操作：激光光源具有较强的激光辐射，请佩戴适当的激光防护眼镜并避免直接暴露于激光光束下。
2. 样本准备：样本应事先处理好并放置在适当的载玻片上，确保样本表面平整，避免气泡或杂质的干扰。
3. 导入样本：轻轻将载玻片插入显微镜主体的样本台中，并用调节旋钮精确定位样本。
4. 参数设置：根据实验需要，设置合适的激光功率、放大倍数和扫描速度等参数，确保获得清晰的图像。
5. 镜头清洁：定期清洁显微镜镜片，避免灰尘或污渍影响成像质量。
注意使用专用的镜头清洁纸和清洁液。
三、操作步骤基于激光扫描共聚焦显微镜的特点，以下为一般操作步骤的指导：1. 打开设备电源，等待设备启动并进行自检。
2. 调节放大倍数：通过显微镜主体上的放大调节旋钮，调节适当的放大倍数，以便观察到合适大小的图像。
3. 确定激光功率：在控制系统中，设置合适的激光功率以激发样本的荧光信号，避免过高的功率导致样本损伤。
4. 调整扫描速度：通过控制系统中的扫描速度调节器，设置合适的扫描速度，以获得清晰且稳定的图像。
5. 对焦样本：使用显微镜主体上的对焦调节旋钮，将样本调焦至最清晰状态。
6. 开始扫描：通过控制系统中的扫描启动按钮，启动扫描功能，并观察图像显示区域是否居中和清晰。
激光扫描共聚焦显微镜操作手册
激光扫描共聚焦显微镜（A1R-si）操作指南目录第一章：Ti-E 显微镜操作2-7 显微镜光路调节和照明注意事项 6Ti-E 物镜，DIC 插片，DIC 棱镜对照表7第二章：共聚焦开关机8-10 第三章：共聚焦图像拍摄1-38NIS-Elements C 软件开启和操作界面简介1-15NIS-Elements C 的实时图像获得基本操作16-23图像拍摄24-27探测模式（标准探测器）设置28-38 第四章: 图像的保存和查看39-42 第五章：图像分析43-46 附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51附件二：图像格式批量转换操作52-53第一章Ti-E 显微镜操作指南（一）认识显微镜各个部件（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温（8）滤色块转盘（包括DIC 检偏器）；平衡片；ND---减光片；“G IF”---绿色滤（9）手动荧光光闸；光片和用于PFS 的红外滤光片；（10）电动焦距调节旋钮；（2）视场光阑；（11）ND 减光片；（3）聚光器升降旋钮；（12）遥控器；（4）起偏器（DIC 用）；（13）透射光电源；（5）聚光器对中旋钮；（14）汞灯荧光光源；（6）孔径光阑；（15）PFS 控制器（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（16）HUB 控制器遥控器示意图(根据具体配置有些图标可能不显示)1）物镜切换按钮；2）滤光块，DIC 检偏器切换按钮；3）DIC 检偏器快速切换按钮；4）光路端口切换按钮；5）PFS 开关控制按钮；6）聚光器转盘切换按钮；7）透射光源控制按钮*。
*请注意：CNTL 按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL 功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。
前面板示意图1）状态显示屏；2）PFS 开关按钮和PFS 聚焦状态指示灯（需要选购PFS 部件）；3）光路端口切换按钮；4）中间变倍旋纽；侧面板示意图1）调焦旋钮2）粗微调切换按钮3）物镜切换按钮；4）滤光块，DIC 检偏器切换按钮5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；7）物镜复位；8）物镜向下移动2 毫米；注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB 控制器（显微镜示意图15 位置）右侧的电源开关打开。
共聚焦显微镜使用规章(暂行)
共聚焦显微镜使用规章（暂行）为保证共聚焦显微镜正常和充分的利用，维护好使用秩序，更好的为各位服务，特制订本规则，请切实严格遵守。
一、简介：共聚焦显微镜为蔡司LSM710，位于生科楼D511室，该显微镜有优异的灵敏度、反差度和稳定性，可广泛用于细胞与组织的免疫荧光染色实验、活细胞成像实验、以及光漂白实验等，结合软件的强大功能，可对图片做各种后期处理，如进行组织切片的3D重构，荧光强度的定量检测以及共定位系数的测定等。
本显微镜配备物镜倍数为10×、20×、40×和63×，激发光源为405 nm、458 nm、488 nm、514 nm、543 nm和633 nm。
二、预约规则：1、对外开放时间暂定为每周一、三下午14点至17点，其他时段需与管理员沟通协调。
预约仅限2周之内，并至少提前24小时。
由管理员按预约先后安排实验。
如预约取消或更改，需至少提前24小时告知，若预约无更改，管理员一律按预约起始时间开机待用，开机时间自此算起。
开机待用时间超过1小时按取消处理，管理员将关闭系统，预约实验者须支付1小时费用。
2、每次预约上机时间不得超过三小时，活细胞成像实验可酌情延时，但最长不得超过6小时。
每次预约仅限一个时段，请勿一次连续预约多个时段。
3、开放对象：不对非本校人员开放，仅本校人员的课题方可使用该仪器，对外合作课题必须是本校人员承担部分，一经发现非本校人员利用本校人员名义使用该仪器者，取消该实验室全体人员使用资格半年。
4、收费标准：按实际使用时间（即从开机到用毕关机的时间）收费300元/小时，不足1小时者，按1小时计。
费用结算方式另行通知。
5、预约方式：请通过网上预约平台进行预约，等待管理员审核通过。
预约时请务必提交以下详细信息：姓名（限两人以内）、所属实验室、联系方式、预约时段、样品性质（细胞贴片、组织切片或活细胞）、实验所用荧光染料的种类。
其他未尽事宜请及时与管理员沟通。
激光共聚焦扫描显微镜技术参数
激光共聚焦扫描显微镜技术参数工作环境：仪器正常运转对工作环境适应的电压波动范围应符合中国实际情况（一般为不低于220V、50Hz、10A范围），适合使用的温度范围15-25℃；使用湿度较宽，在此范围内，温度、湿度正常变化对仪器稳定性影响小。
提供适合的设备以达到抗震动性要求。
1.激光器：激光器谱线按如下配置:* 1.1 可见光固体激光器（3个）：488nm、532nm、635nm1.2 紫外激光：405nm，功率：不小于25mw1.3 AOTF：所有激光能量均由AOTF控制，连续可调。
2．扫描头：2.1扫描头与显微镜完全一体化，相差及色差完全一体化校正。
* 2.2顺序扫描时八个荧光共聚焦通道，一个效果良好的透射光通道。
所有荧光通道均为光谱通道。
2.3扫描头应具备多标记荧光顺序扫描操作，每个通道光切平面与光切厚度完全一致。
共聚焦通道配置可调大小的共聚焦针孔, 针孔形状：圆形。
2.4单次扫描采集荧光光谱分布曲线，并对荧光光谱进行分析和分离不同标记的信号，可以解决同时使用多种荧光标记时激发光或发射光波长重叠造成的串色问题*2.5可自由选择所有荧光通道检测的波长范围, 所有通道检测范围为430－750nm。
检测波长范围及中心连续任意可调。
光谱分辨率5nm.2.6扫描分辨率：2048×2048 。
大于或等于8位。
2.7扫描方式：能够进行X, Y, Z, T, λ（光谱）扫描，λ扫描必须为实施的同步扫描。
3.显微镜部分3.1研究型编码倒置显微镜。
*3.2六位物镜转换器，最小步进≤3.8nm，调焦行程≥12mm, 防漂移设计，有调焦限位。
* 3.3科勒照明，3200K恒定色温系统3.4显微镜透射光源：LED光源，寿命2.5万小时* 3.5荧光：外置荧光灯，金属卤素灯寿命大于2000小时，可实现自动荧光光强管理。
3.6显微镜下成像和PMT成像必须同步，成像清晰度完全相同。
*3.7目镜：10X，视场数25mm*3.8物镜：确保紫外与可见光共定位的物镜10X，数值孔径不低于0.3040X，数值孔径不低于0.7563X，数值孔径不低于1.40-1.603.9 6位荧光滤块电动转换。
激光共聚焦显微镜FV中文说明书完整版
激光共聚焦显微镜FV中文说明书完整版激光共聚焦显微镜F V中文说明书HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】激光共聚焦显微镜FV1000(倒置显微镜IX81) 简易使用说明书开启系统1.打开计算机.2.打开激光器.(打开钥匙开关.) 2-1.多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) ON2-2氦氖绿 (543 nm) ON 2-3氦氖红 (633 nm) ON 3.打开汞灯电源开关. 4.登陆Windows XP 系统. User ID: Administrator Password: fluoview5.双击快捷方式：User ID: Administrator Password: Administrator* 系统软件的启动需要等待一定时间.5231显微镜镜下观察微分干涉差观察1.使用手控面板选择物镜.(参照Memo.)2.插入起偏镜.3.插入微分干涉滑块.4.点击FV10-ASW 软件中的图标.Note1:使用TD 滑块控制卤素灯的光强；Note2:检查滤色片转盘的位置是否为“”，如果不是，用手柄按下DICT 图标 5.标本聚焦显微镜镜下观察荧光观察*DIC 元件124手控面板用此旋钮进行微分干涉法对比度的调节 .Memo按照 7-1 的操作转换物镜的倍率之后，对：●物镜●各物镜对应的 D IC 元件 * 进行操作 .1.使用手控面板选择物镜.2.点击FV10-ASW 软件中的图标.3.使用手控面板选择荧光滤色片.(参照Memo.)4.标本聚焦.123Hand switchNote 2Notes 1 & 3Memo关于荧光滤色片NIBA ：蓝色激发 / 绿色荧光（例： FITC 、 EGFP 等） WIG ：绿色激发 / 红色荧光（例： Rhodamine 、 DsRed 等）扫描模式扫描速激光输出的调节明场观察( 显微镜镜下观察 )荧光观察( 显微镜镜下观察 )扫描的按钮选择 XYZ,XYT 或 X YL 每个通道的调节共聚焦的孔径大小卤素灯的光强调节 Kalman 方式染料选择光路图取图条件的保存调出取图条件TwinScanner 设定图像的拇指索引图像显示窗口内存中所显示的文件Lambda 扫描的设定物镜聚焦时间间隔和时间计数( 用于 XYT或 X T 扫描) λ 扫描带宽选择获取单张图像（XY平面）（荧光图像）例：绿色荧光染色（FITC）1.点击FV10-ASW软件中的按钮关闭汞灯快门 .同时, 点击按钮关闭卤素灯快门.2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3.点击Apply按钮.(关闭染料选择面板可以用Close按钮.)123染料选择后的显示界面Memo扫描控制面板: 连续扫描 : 停止扫描: 快速扫描 ( 隔行扫描 )4564. 点击 X Y Repeat 按钮开始扫描 .5. 调节绿色 FITC ) ( 图像 .( 图像调节的略述如下 .更多的信息 ,参照附录 1.) 6. 点击 S top 按钮停止扫描 .(参照 Memo .[1探测器的灵敏度调节 HV ( )[2共聚焦的孔径大小调节 ( . ) [3激光输出的调节 ( Laser ) [1[2 [3调节方法 ( 例 : HV 调节 ) :点击滑块 , HV 直接提高 ( 或降低 ) 到指定的位置 .点击此按钮或者使用鼠标转轮进行微调 .图像调节略述7.选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation 方式. 更多的信息，参照附录2.)8.点击XY 按钮取得一幅图像.9.点击SeriesDone 按钮, “2D View - LiveImage(x)” 2D 界面就出现.10.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW 软件专用的图像格式.)78910MemoFV10-ASW 专用的图形格式OIF 格式 :创建“ 一个含 (16- bit TIFF ) 的图像” 和“ 一个附属文件 ,不能单独分割 .OIB 格式 : 创建单个的 O IF 格式的文件 , 方便进行移动和进行其它的操作 .1.点击FV10-ASW 软件中的按钮关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮关闭卤素灯快门.2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3.点击Apply 按钮. (关闭染料选择面板可以用Close 按钮.)同步扫描 123染料选择后的显示界面44. 点击 X Y Repeat 按钮开始扫描 .5. 调节绿色 Alexa ( Fluor 488) 图像和红色( Alexa Fluor 546) 图像 .( 图像调节的略述如下 .更多的信息 ,参照附录 1.) 6. 点击 S top 按钮停止扫描 .(参照 Memo .56Memo扫描控制面板: 连续扫描 : 停止扫描: 快速扫描 ( 隔行扫描 )[1探测器的灵敏度调节 ( HV )[2共聚焦的孔径大小调节 ) ( . [3激光输出的调节 ( Laser) [1[2[3调节方法 ( 例 : HV 调节 ) :点击滑块 , HV 直接提高 ( 或降低 ) 到指定的位置 .点击此按钮或者使用鼠标转轮进行微调 .图像调节略述7.选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下,背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation 方式. 更多的信息，参照附录2.)8.点击XY 按钮取得一幅图像.9.点击SeriesDone 按钮, “2D View - LiveImage(x)” 2D 界面就出现.10.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW 软件专用的图像格式.)获取单张图像（XY 平面）（荧光图像）78910MemoFV10-ASW 专用的图形格式OIF 格式 : 创建“ 一个含 (16- bit TIFF ) 的图像” 和“ 一个附属文件 ,不能单独分割 . OIB 格式 : 创建单个的 O IF 格式的文件 , 方便进行移动和进行其它的操作 .例：绿色荧光（ Alexa 488 ）＋红色荧光（ Alexa 546）二重染色序列扫描 (这里介绍线序列扫描.)1.点击FV10-ASW 软件中的按钮关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮关闭卤素灯快门.2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3.点击Apply 按钮.(关闭染料选择面板可以用Close 按钮.)123染料选择后的显示界面4 5 6 74.点击序列扫描,并选择线序列方式.5.点击X Y Repeat按钮开始扫描.6.调节绿色(Alexa Fluor488)图像和红色(Alexa Fluor546)图像.(图像调节的略述如下.更多的信息,参照附录1.)7.点击S top按钮停止扫描.(参照Memo.[1探测器的灵敏度调节(HV)[2共聚焦的孔径大小调节)(.[3激光输出的调节Laser)([1[2[3调节方法(例: HV调节):点击滑块, HV直接提高(或降低)到指定的位置.点击此按钮或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述8.选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下,背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation 方式. 更多的信息，参照附录2.)9.点击XY 按钮取得一幅图像.10点击SeriesDone 按钮, “2D View - LiveImage(x)” 2D 界面就出现.11.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW 软件专用的图像格式.)891011MemoFV10-ASW 专用的图形格式OIF 格式 :创建“ 一个含 (16- bit TIFF ) 的图像” 和“ 一个附属文件 ,不能单独分割 . OIB 格式 : 创建单个的 O IF 格式的文件 , 方便进行移动和进行其它的操作 .(XY 平面-单标+微分干涉差)1. 点击FV10-ASW 软件中的按钮关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮关闭卤素灯快门.2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料.*取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2.3.点击Apply 按钮.(关闭染料选择面板可以用Close 按钮.)4.选择TD1.1234(XY平面-单标+微分干涉差)5 5.点击X Y Repeat按钮开始扫描.6.调节绿色()FITC图像和微分干涉差的图像.(图像调节的略述如下.更多的信息,参照附录1.)7.点击S top按钮停止扫描.(参照Memo.67Memo扫描控制面板:连续扫描:停止扫描:快速扫描(隔行扫描)[1探测器的灵敏度调节(HV)[2共聚焦的孔径大小调节.)([3激光输出的调节(Laser)[1[2[3调节方法(例: HV调节):点击滑块, HV直接提高(或降低)到指定的位置.点击此按钮或者使用鼠标转轮进行微调.图像调节略述(XY 平面-单标+微分干涉差)8. 选择AutoHV, 并选择扫描速度.* 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除.(也可以使用Kalman accumulation 方式. 更多的信息，参照附录2.)9.点击XY 按钮取得一幅图像.10.点击SeriesDone 按钮, “2D View - LiveImage(x)” 2D 界面就出现.11.保存该幅图像:右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像.(保存为“xml”类型是 FV10-ASW 软件专用的图像格式.) 891011MemoFV10-ASW 专用的图形格式OIF 格式 : 创建“ 一个含 (16- bit TIFF ) 的图像” 和“ 一个附属文件 ,不能单独分割 . OIB 格式 : 创建单个的 O IF 格式的文件 , 方便进行移动和进行其它的操作 .(XYZ 扫描-双标)1.采用13和14页步骤1到7. 确定Z 轴的上限和下限如下.2.输入StepSize 大小(点击OP 按钮可以使用推荐的值), 并选择 .3.点击XY Repeat 按钮开始扫描.4.点击按钮上移焦点位置.(参照Memo.)5.当图像显示到达上限时, 点击Set 按钮确定. 6.点击按钮下移焦点位置.(参照Memo.)7.当图像显示到达下限时, 点击Set 按钮确定.8.点击Stop 按钮停止扫描.和和1456728Memo和按钮: 点击移动μ m. : 点击移动μ m.。
激光共聚焦显微镜校准规范 编制说明
激光共聚焦显微镜校准规范（征求意见稿）编制说明一、任务来源激光共聚焦显微镜(Laser confocal microscope，LCM)是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新型光学显微技术，它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段的延伸，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的光学三维成像分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具。
激光共聚焦显微镜广泛应用于对细胞形态结构和各种材料的表面微曲形貌进行综合测量分析，同时在半导体集成电路、生物工程、制药等产业中得到广泛应用。
激光共聚焦显微镜的验收和日常检测中需要校准来保证量值准确，所以激光共聚焦显微镜校准规范的制定将确保其测量准确可靠，量值统一、可溯源，对我国激光共聚焦显微镜在科学与产业中的应用具有重要意义，为纳米技术和生物医学技术的发展提供保障。
根据国家市场监督管理总局计量函【2019】42号《市场监管总局计量司关于国家计量技术规范制定、修订及宣贯计划有关事项通知》，受全国几何量长度计量技术委员会的委托，由中国计量科学研究院负责制定《激光共聚焦显微镜校准规范》技术规范的工作。
二、国内共聚焦显微镜的技术现状目前，国内外生产激光共聚焦显微镜的厂家较多，表1列出了现有主流激光共聚焦显微镜的技术指标：表1 激光共聚焦显微镜的主要技术指标统计2三、制定规程主要的参考资料和依据制定本规程的主要参考资料主要有：JJF 1071-2010 国家计量校准规范编写规则JJF 1001-2011 通用计量术语及定义ISO 5178-607-2019 Geometrical product specifications (GPS) –Surfacetexture: Areal Part 607: Nominal characteristics ofnon-contact (confocal microscopy) instruments GB/T 19067.1-2003 产品几何技术规范（GPS）表面结构轮廓法测量标准第一部分：实物测量标准进行不确定度评定的主要技术依据有：JJF1059.1-2012 测量不确定度评定与表示四、规程的主要内容本规程为了使激光共聚焦显微镜对社会出具准确、可靠、有效的数据，满足各行业领域的检测需求并对仪器的计量性能进行较为全面的评价，规程起草小组对仪器的主要性能的技术指标进行统一、合理、符合实际的规定。
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激光共聚焦显微镜校准规范（征求意见稿）
编制说明
一、任务来源
激光共聚焦显微镜(Laser confocal microscope，LCM)是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新型光学显微技术，它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段的延伸，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的光学三维成像分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具。
激光共聚焦显微镜广泛应用于对细胞形态结构和各种材料的表面微曲形貌进行综合测量分析，同时在半导体集成电路、生物工程、制药等产业中得到广泛应用。
激光共聚焦显微镜的验收和日常检测中需要校准来保证量值准确，所以激光共聚焦显微镜校准规范的制定将确保其测量准确可靠，量值统一、可溯源，对我国激光共聚焦显微镜在科学与产业中的应用具有重要意义，为纳米技术和生物医学技术的发展提供保障。
根据国家市场监督管理总局计量函【2019】42号《市场监管总局计量司关于国家计量技术规范制定、修订及宣贯计划有关事项通知》，受全国几何量长度计量技术委员会的委托，由中国计量科学研究院负责制定《激光共聚焦显微镜校准规范》技术规范的工作。
二、国内共聚焦显微镜的技术现状
目前，国内外生产激光共聚焦显微镜的厂家较多，表1列出了现有主流激光共聚焦显微镜的技术指标：
表1 激光共聚焦显微镜的主要技术指标统计
2
三、制定规程主要的参考资料和依据
制定本规程的主要参考资料主要有：
JJF 1071-2010 国家计量校准规范编写规则
JJF 1001-2011 通用计量术语及定义
ISO 5178-607-2019 Geometrical product specifications (GPS) –Surface
texture: Areal Part 607: Nominal characteristics of
non-contact (confocal microscopy) instruments GB/T 19067.1-2003 产品几何技术规范（GPS）表面结构轮廓法测量标准
第一部分：实物测量标准
进行不确定度评定的主要技术依据有：
JJF1059.1-2012 测量不确定度评定与表示
四、规程的主要内容
本规程为了使激光共聚焦显微镜对社会出具准确、可靠、有效的数据，满足各行业领域的检测需求并对仪器的计量性能进行较为全面的评价，规程起草小组对仪器的主要性能的技术指标进行统一、合理、符合实际的规定。
检定项目主要有以下几项：①仪器外观及通电检查、②畸变、③测量示值误差、④测量重复性、⑤水平方向正交性误差、⑥最大可测局部倾斜等。
起草小组对主要性能的检定方法和各项指标的要求、检定结果的判定等做了统一的规定，同时对校准条件、校准用样板等也做了统一的要求。
4.1 畸变
畸变是激光共聚焦显微镜在进行图像测量和三维测量时重要技术指标之一，是限制光学量测准确性的重要因素之一。
畸变定义为实际像高与理想像高差，而在实际应用中经常用实际像高与理想像高之比的百分数来表示畸变，称为相对畸变。
常见的畸变有枕形畸变、桶形畸变，如图1所示。
在本规程中选用最常用的二维栅格试样评价仪器畸变，具体过程可参见本规程（征求意见稿）。
（a）无畸变（b）枕形畸变（c）桶形畸变
图1 常见畸变类型
4.2 测量示值误差
测量示值误差是激光共聚焦显微镜在进行长度测量校准时重要的技术指标之一，具体可分为水平（X轴、Y轴）方向测量示值误差和垂直方向测量示值误差。
在本规程中选用高等级的光栅样板和台阶样板评价仪器的示值误差，以视场范围内测量值减去样板标称值作为测量示值误差，具体过程可参见本规程（征求意见稿）。
4.3 测量重复性
测量重复性是激光共聚焦显微镜的主要测量功能之一，因此仪器测量重复性也是该类仪器的重要技术指标。
在本规程中选用最常用的实验标准差法评价仪器的重复性，具体过程可参见本规程（征求意见稿）。
4.4 水平方向正交性误差
水平方向正交性误差是激光共聚焦显微镜的三维测量重要指标之一，在本规程中以X轴中线和Y轴中线夹角与90°的偏差评价水平方向正交性误差，具体过程可参见本规程（征求意见稿）。
4.5 最大可测局部倾斜
最大可测局部倾斜是指共聚焦显微镜能够探测的光学表面局部区域最大斜率，是决定共聚焦显微镜适用范围的重要指标之一。
对于超过最大可测局部倾斜的高曲率样品，共聚焦显微镜不具备准确测量的能力。
在本规程中选用标准微球阵列样品作为校准仪器的标准样品，标准微球尺寸选择参见本规程（征求意见稿）。
最大可测局部倾斜即为微球圆心角半角α，其计算示意图如下，根据测量的球冠形貌上(a1, b1)，(a2, b2)，(a3, b3)三点坐标确定球冠矢高H和半弦长L的大小，然后根据本规程（征求意见稿）中公式（5）计算最大可测局部倾斜α大小。
图2 最大可测局部倾斜计算示意图
五、总结
在本规程的制定过程中，我们以国内外资料及相关标准和实验数据作为技术依据，本着科学合理、易于操作的原则，制定了激光共聚焦显微镜校准规范（征
求意见稿）。