细胞培养无菌操作技术
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❖ (一)培养前准备
❖ 为了做好培养前准备工作，宜制定出分门 别类的操作卡片，如“分装血清”、“组 织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等 等。各卡片上记有需用器材和物品名称、 要求及数量等，实验者可按卡片收集所用 物品，清点无误后，把用品放置于操作场 地，然后进行消毒，可避免操作开始后， 因物品不全在往返拿取时增加污染机会。
2、胶塞的清洗
❖ 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应 先用自来水冲洗，再做常规处理
❖ (三)实验结束后，将实验物品带出工作台。 如需要继续进行下一个实验，则用70%酒 精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风 机运转10 分钟后，才可进行下一个实验 操作。 无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞， 必要物品，如试管架、移液器或吸管头等 可以暂时放置，其它实验用品用完后应及 时移出，以利气体流通。
二、细胞培养所用器皿的清洗与消毒
（一）清洗
❖ 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害 物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质
❖ 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗
1、玻璃器皿的清洗
❖ 包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 ❖ 清洗后的玻璃器皿
❖ 3．火焰消毒：在无菌环境进行无菌操作时 首先要点燃酒精灯,以后操作如安装吸管帽、 启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。 已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼， 因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再 用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要 求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗， 表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入 培养液内。因此酒精灯需用96％的不含杂 质的酒精，绝不能含有二甲苯和甲醇。
❖ 洗液对皮肤、衣物等均有腐蚀作用，故应 妥善保存。配制及使用时应注意安全，须 穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及 身体裸露部分
❖ 配成后清洁液一般为棕红色，若使用的次 数过多，重铬酸钾就被还原为绿色的铬酸 盐，效力减小，此时可加热浓缩或补加重 铬酸钾，仍可继续使用。为防止吸收空气 中的水分而变质，洗液贮存时应加盖。
干净透明无油迹 不能残留任何物质
❖ 浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿
均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被 溶掉
新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运 输过程中，玻璃表面带有大量的干固的 灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些 对细胞有害的物质等
❖先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐 酸液浸泡过夜，中和wk.baidu.com中的碱性物质
❖ 1．操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效 果很好。用30 瓦紫外线管灯，操作箱消毒 20 一30 分钟即可；操作室空间大，需消 毒30～50 分钟。净化工作台亦可设紫外线 灯，主要用于消毒台面上用品，但对台面 流动的空气无意义。在用紫外线灯照射期 间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用 液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张 覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野 用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线， 会降低消毒效果。
❖ 附有蛋白质类或血液较多的玻皿，切勿用 洗液，因易使其凝固。
❖ 冲洗
在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水 充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁 液的残迹
最好用洗涤装置
如用手工操作
❖需流水冲洗十次以上，每次水须灌 满及倒干净，蒸馏水浸泡过夜，自 来水冲洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水 3遍，培养瓶要求二蒸水也用流水， 烤干备用
第三章 基本培养技术
第一节 无菌操作的基本技术
防止污染是决定培养成功或失败的首要条 件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力， 故在一切操作中要努力做到最大限度的无 菌。
细胞培养无菌操作基本技术分三个部分： 工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻 璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞 的处理。
一、工作环境的处理
❖ (二)培养操作
❖ 进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又 不必太快，以防空气流动，增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要 用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时， 应取备品更换。为便于拿送用品，工作台 面上的用品要有合理的布局.
❖ 原则上应是右手使用的东西放置在右侧， 左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作 由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞 在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。 培养液在末用前，不要过早开瓶；用后如 不再重复使用，应立即封口。培养用瓶开 瓶以后，应保持45 度斜位或平放，开口 向上长时间直立可增加落菌机会。吸取各 种用液时均应分别使用吸管，不能混用， 以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作 中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫 把细菌或支原体带入工作台面发生污染。
❖ 2．洗手和着装：原则上和外科手术相同。 在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入 箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。可用软 塑料瓶内盛75％酒精，瓶口插一弯管，右 手捏出三五毫升入左手内，进行擦洗消毒 极为简便；必要时亦可用0.2％的新洁尔灭 洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化 台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即 可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。
浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器 皿露出清洁液面
浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 ❖ 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸
（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 63∶1000∶200 次强清洗液 120∶ 200∶1000 弱清洁液 100∶ 100∶1000
❖ 配制时可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢 加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产 生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。 配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫 酸遇水瞬间产生大量的热量使水沸腾，体 积膨胀而发生爆溅）。
再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使 用过的蛋白质，干固后不易洗掉
❖用后立即浸入水中，要求完全浸入， 不能留有气泡或浮在液面上
❖刷洗：
用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附 着较牢的杂质
刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度
❖ 浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中
清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧 化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质
❖ 为了做好培养前准备工作，宜制定出分门 别类的操作卡片，如“分装血清”、“组 织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等 等。各卡片上记有需用器材和物品名称、 要求及数量等，实验者可按卡片收集所用 物品，清点无误后，把用品放置于操作场 地，然后进行消毒，可避免操作开始后， 因物品不全在往返拿取时增加污染机会。
2、胶塞的清洗
❖ 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应 先用自来水冲洗，再做常规处理
❖ (三)实验结束后，将实验物品带出工作台。 如需要继续进行下一个实验，则用70%酒 精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风 机运转10 分钟后，才可进行下一个实验 操作。 无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞， 必要物品，如试管架、移液器或吸管头等 可以暂时放置，其它实验用品用完后应及 时移出，以利气体流通。
二、细胞培养所用器皿的清洗与消毒
（一）清洗
❖ 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害 物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质
❖ 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗
1、玻璃器皿的清洗
❖ 包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 ❖ 清洗后的玻璃器皿
❖ 3．火焰消毒：在无菌环境进行无菌操作时 首先要点燃酒精灯,以后操作如安装吸管帽、 启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。 已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼， 因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再 用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要 求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗， 表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入 培养液内。因此酒精灯需用96％的不含杂 质的酒精，绝不能含有二甲苯和甲醇。
❖ 洗液对皮肤、衣物等均有腐蚀作用，故应 妥善保存。配制及使用时应注意安全，须 穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及 身体裸露部分
❖ 配成后清洁液一般为棕红色，若使用的次 数过多，重铬酸钾就被还原为绿色的铬酸 盐，效力减小，此时可加热浓缩或补加重 铬酸钾，仍可继续使用。为防止吸收空气 中的水分而变质，洗液贮存时应加盖。
干净透明无油迹 不能残留任何物质
❖ 浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿
均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被 溶掉
新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运 输过程中，玻璃表面带有大量的干固的 灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些 对细胞有害的物质等
❖先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐 酸液浸泡过夜，中和wk.baidu.com中的碱性物质
❖ 1．操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效 果很好。用30 瓦紫外线管灯，操作箱消毒 20 一30 分钟即可；操作室空间大，需消 毒30～50 分钟。净化工作台亦可设紫外线 灯，主要用于消毒台面上用品，但对台面 流动的空气无意义。在用紫外线灯照射期 间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用 液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张 覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野 用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线， 会降低消毒效果。
❖ 附有蛋白质类或血液较多的玻皿，切勿用 洗液，因易使其凝固。
❖ 冲洗
在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水 充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁 液的残迹
最好用洗涤装置
如用手工操作
❖需流水冲洗十次以上，每次水须灌 满及倒干净，蒸馏水浸泡过夜，自 来水冲洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水 3遍，培养瓶要求二蒸水也用流水， 烤干备用
第三章 基本培养技术
第一节 无菌操作的基本技术
防止污染是决定培养成功或失败的首要条 件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力， 故在一切操作中要努力做到最大限度的无 菌。
细胞培养无菌操作基本技术分三个部分： 工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻 璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞 的处理。
一、工作环境的处理
❖ (二)培养操作
❖ 进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又 不必太快，以防空气流动，增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要 用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时， 应取备品更换。为便于拿送用品，工作台 面上的用品要有合理的布局.
❖ 原则上应是右手使用的东西放置在右侧， 左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作 由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞 在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。 培养液在末用前，不要过早开瓶；用后如 不再重复使用，应立即封口。培养用瓶开 瓶以后，应保持45 度斜位或平放，开口 向上长时间直立可增加落菌机会。吸取各 种用液时均应分别使用吸管，不能混用， 以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作 中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫 把细菌或支原体带入工作台面发生污染。
❖ 2．洗手和着装：原则上和外科手术相同。 在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入 箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。可用软 塑料瓶内盛75％酒精，瓶口插一弯管，右 手捏出三五毫升入左手内，进行擦洗消毒 极为简便；必要时亦可用0.2％的新洁尔灭 洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化 台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即 可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。
浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器 皿露出清洁液面
浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 ❖ 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸
（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 63∶1000∶200 次强清洗液 120∶ 200∶1000 弱清洁液 100∶ 100∶1000
❖ 配制时可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢 加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产 生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。 配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫 酸遇水瞬间产生大量的热量使水沸腾，体 积膨胀而发生爆溅）。
再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使 用过的蛋白质，干固后不易洗掉
❖用后立即浸入水中，要求完全浸入， 不能留有气泡或浮在液面上
❖刷洗：
用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附 着较牢的杂质
刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度
❖ 浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中
清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧 化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质