讲义4：微生物基本操作规范(4)接种、分离纯化

4.2接种法与纯培养的分离技术 4.2接种法与纯培养的分离技术
含有一种以上的微生物培养物称为 混和培养物（Mixed culture）。 混和培养物 如果在一个菌落中所有细胞均来自 于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯 纯 培养（Pure culture）。 培养 在进行菌种鉴定时，所用的微生物 一般均要求为纯的培养物。得到纯培养 的过程称为分离纯化 分离纯化。 分离纯化
食品微生物检验 规范操作基础培训
4 接种、分离纯化 接种、
福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室 2010.05
主要内容： 主要内容： §1 §2 §3 清洗、 清洗、消毒和灭菌操作 培养基的制备 采样和取、 采样和取、制样
§4
§5 §6
接种、分离纯化 接种、
制片、 制片、染色及显微观察 实验室安全基础知识
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌 的工具（如接种针和吸管等）在无菌条 件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌 悬液等）于培养基上，这个过程叫做无 菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必须是 无菌操作。 无菌操作
接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接 种的器具必须经干热或火焰等灭菌。 接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上 充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过 火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环 冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体， 迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄 部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环， 以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿 的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养 基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边， 试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
斜线接种示意图
3.方格划线法 3.方格划线法
将培养物涂布于平板上1/5处，接种环经 火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条， 将接种环灭菌后，划垂直线5~6条，使呈正方 形格。其他操作同前。
细菌在固体培养基表面只能在固定的 地方生长繁殖，经过一定的培养时间后， 可形成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一 种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。 菌落形态往往有助于初步识别细菌；还可 以由此获得细菌而进行一系列的鉴定。 识别菌落的能力是从事微生物检验人 识别菌落的能力 员的极为重要的基本功。
4.3.1 培养的类型
1.液体批量培养：在液体培养基中培养，培养过程不 需要加入新的培养基。 2.琼脂斜面培养：在试管中装入约5mL固体培养基融 化后摆成斜面冷却。将接种物涂布到斜面或用接种 环在斜面上划线。 3.穿刺培养：将含琼脂培养基的试管或瓶子垂直放置， 使培养基凝固，用接种针挑取少量接种物垂直穿入 至容器的中部。 4.半固体培养：菌株生长的培养基含有足够的琼脂 （0.02%~0.3%）使其有一定的黏度，但却没有完全 固化。 5.振荡培养：用摇床进行微生物振荡培养。 6.平板培养：平板划线法、倾倒平皿法。
图4-5 倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解
1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水
稀释倒平板和涂布法
4.2.6涂布平板法 4.2.6涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释， 取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的 琼脂平板上，然后用灭菌的L型玻璃棒把稀 释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温 培养后即可观察。（图4-5 b）
4.2.4 穿刺接种法
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等 也可以用于观察细菌的某些生化反应。 1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基 的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底 部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路 退出。 3.经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生 长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺 线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整 个培养基混浊表示细菌有动力。
4.3.2 微生物的培养方法
根据培养时是否需要氧气，可分为：
1.好氧培养：
(1)固体表面培养法 ：斜面、培养皿、克氏瓶等 (2)液体培养法：静止、摇瓶振荡
2.厌氧培养：
(1)深层穿刺培养 (2)化学吸氧与深层穿刺相结合 (3)抽气法：干燥器、简易的真空和气体交换法、厌氧罐
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4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上 取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中， 在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起 向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。 5.取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先 塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好。 6.做好标识，置35℃培养 箱中培养18~24小时。 斜面培养一般形成均匀一 致的菌苔。一般可观察表 面、透明度、色泽等特征。
5)构造 构造:均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。 构造 6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧 颜色： 颜色 光绿、金黄色、柠檬色、红色等、 7)透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。 透明度： 透明度 8)硬度：硬、软、干燥、湿润，是否附着于培养基 硬度： 硬度 上或嵌入培养基内不易刮取。 9)质地：脂状、粘液状、膜状等。 质地： 质地 10)乳化性：在盐水中研磨是否形成均匀乳剂或颗 乳化性： 乳化性 粒状。 11)溶血性：在血平板上，菌落周围有无溶血环。 溶血性： 溶血性
图4-4 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
4.2.3 液体接种法
1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近 液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和， 使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以 18~24小时培养后观察生长特征。 肉汤培养可观察如下几项：
4.2.1平板划线分离培养法 4.2.1平板划线分离培养法
平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养 物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种 细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据 菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获 得纯种细菌（纯培养）。 分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分 离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方 格法、放射法、四格法等。（图4-2）
图4-2 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
1.曲线划线分离法 1.曲线划线分离法
1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许; 2) 左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和 食指将平板盖打开； 3)右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空 间插入平板内，使接种环与培养基表面呈 45℃角，在酒精灯上方5~6cm处划线接种。先 在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回 以曲线形式作连续划线接种，线与线间留有 适当距离，将整个平板表面划满曲线； 4)注明标识后，置35℃培养箱中培养，一般在 18~24小时后观察结果。
4.3 微生物的培养 微生物的培养
研究和鉴定细菌时所提到细菌的特征指的是细菌 菌落的特征，而不是单个细菌的特征。大量食品微 生物的质量检测是对可见菌株的检测，现在衍变到 给待检测细菌提供适当的条件使之代谢繁殖后再进 行检测。因此在细菌学研究中，最基本的要求是有 能促使单个细菌生长和繁殖的物质和方法。能给细 菌提供适当生长环境的营养物质称为培养基。 根据接种培养方式的不同，可将培养基以多种形 式分装到试管、三角瓶或螺帽瓶中，试管或三角瓶 的瓶口可用适当的棉塞、金属帽、塑料帽等盖紧。 螺帽的优势是能够阻止蒸汽蒸发，避免培养基在保 存过程中干燥。
图4-3 细菌的培养特征 1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根 状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状
§4接种、分离纯化
4.1接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人 工培养基上或活的生物体内的过程叫做 接种。
4.1.1接种工具 4.1.1接种工具
图4-1 接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
4.1.2无菌操作 4.1.2无菌操作
4.2.2 斜面接种法
主要用于经划线分离培养所获得的单个菌 落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。 以菌种移种为例，其接种方法是： 1.取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、 无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌 种管位于外侧，培养基管位于内侧。 2.右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌 接种环。 3. 以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取 棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过 火焰1~2次。
2.斜线(分区)划线分离法 2.斜线(分区)
1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次 划线,再在2、3……区依次划线。 2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷 后再划下一区域。 3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2次， 使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。 4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。
菌落形态观察
1)大小 大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、 大小 培养基及培养时间等条件而不同。同一种细 菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处 小。因此，表示菌落大小时，应注明培养基 名称。一般以培养18~24小时后，选散在处的 18~24 菌落大小。1mm左右为小菌落；2~3mm为中 1mm 2~3mm 等大；3mm以上 以上为大菌落。 以上 2)形状及边缘：圆形、不规则、放射状、树根 形状及边缘： 形状及边缘 状、边缘整齐、波形、锯齿状、卷发状等。 3)隆起：平的 隆起： 隆起 平的、突起的、凸面的、凸形的等。 4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有无光 表面： 表面 泽等。
4.2.5来自百度文库注平板法 4.2.5倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取 一定量（1mL）的稀释液加入已熔化并冷却至 45~50℃的15mL（使用直径90mm的平皿时）普 通琼脂管中，立即摇匀，趁琼脂未凝固前倾 注于已灭菌的平皿中，待凝固之后，将平板 倒置在培养箱中培养。 （图4-5 a） 培养后观察，细菌大部分分散于琼脂层 内，形成深层菌落，有一部分可生长于表面。
a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛。 b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、 有颗粒、絮状生长。 c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）。 d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征 （光滑、颗粒、皱状）。 e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察 是否产酸和有无气体。