用于基因治疗的慢病毒载体(一)
分子生物学--慢病毒载体PPT
• 基因转移效率高，整合率也明显高于其他 基因转移方法，对于大型动物的转基因有 很大的诱惑力，可大幅度的节省制备费用， 且易操作。 • 克服了肿瘤性逆转录病毒载体易形成嵌合 体，表达沉默等不利因素。
存在问题
• 随机插入是否干扰插入位点基因表达，甚 至引起突变，整合的拷贝过多 • 安全方面，由于在转基因治疗方面的需要 和考虑，现已有自身灭活的载体可利用。
•就到这里啦！
• 理想的病毒载体能同时提供投向了以Ⅰ型为 人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。
慢病毒特性
• 区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂 细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可 永久性表达。 • 可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌 细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多 种类型的细胞，效果非常理想，因此具有 广阔的应用前景。
• 研究表明，以HIV-1为基础构建的这类慢病 毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因 整合至靶细胞基因组长期表达、转移基因 片段容量较大、免疫反应小等优点，适于 体内基因治疗，因此有望成为理想的基因 转移载体。
慢病毒与疾病治疗
• Lesch-Nyhan综合征是一种遗传性的代谢性 脑病，由编码次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT) 的基因缺陷所引起 • 帕金森氏病是一种退行性脑病 • Alzheimer氏病也是一种多因素引起的退行 性脑病 • 由于HIV-1载体能够体内转导神经元并建立 长期稳定的表达，因此对于以上疾病的基 因治疗非常具有吸引力。
慢病毒与转基因动物制备
• 慢病毒载体与其他转 基因技术方法相结合， 应用于转基因动物的 构建，从而大大提高 了产生转基因动物的 成功率。
• 由于慢病毒载体经改构后，不在宿主细胞 内繁殖，被他感染的或转化的动物细胞不 会死亡，可以连续传代(2~4) 。因此可以用 慢病毒作为载体，改变动物细胞的基因型， 病遗传到子代。
慢病毒载体
逆转录病毒载体、腺病毒载体：
1.逆转录病毒(retrovirus vectors ,RV)载体
逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分:一部 分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载 体;另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转 录病毒结构基因
将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿 主细胞对其进行膜融合和内吞,具有广泛的宿主范围和更高的转染效率,可 高效的转染静止细胞,并能抵抗血清补体灭活的作用。
• 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌 细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞和一些较难转染的细 胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒 载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，而 且大大增加目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组 的几率，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA 的长期、稳定表达。 • 在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒 己经成为表达外 源基因或外源shRNA的常用载体形式之一。 • P.s shRNA是short hairpin RNA 的缩写。翻译为“短发夹RNA。
辅助成分
• 辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生 病毒颗粒的细胞系。 • 慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、 重组的假病毒颗粒所需要的所有辅助蛋白。
• 为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染 细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外 的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目 的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水 平的表达效应分子。
4.单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)载体
单纯疱疹病毒是一种双链DNA病毒,作为基因治疗载体， HSV载体非常 适用于需要基因长时间表达的基因治疗,但在介导肿瘤基因治疗等要求基 因短暂高水平表达的基因转移是不合适。
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。
基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。
近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。
由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。
慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。
病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。
目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议基因治疗是一种新兴的治疗方式，可以通过将特定的基因传递到患者体内，以修复或替代缺陷基因，从而治疗遗传性疾病。
在进行基因治疗时，选择合适的基因传递载体非常重要，因为它可以影响基因的有效性、安全性和稳定性。
在本文中，我们将比较常用的基因传递载体，并给出选择建议。
一、病毒载体病毒载体是最常用的基因传递工具之一。
它们具有高度传染性和高效的基因传递能力。
目前，常用的病毒载体主要包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒。
1. 腺病毒（Adenovirus）腺病毒被广泛用于基因治疗研究中。
它们能够传递大分子量的基因，并能够感染广泛的细胞类型。
腺病毒具有较高的转染效率和较短的表达时间，但由于免疫反应等问题，其基因传递效果较为有限。
2. 逆转录病毒（Retrovirus）逆转录病毒是一种RNA病毒，它能够将其RNA转录成DNA，并将其整合到靶细胞的基因组中。
逆转录病毒能够传递长期稳定的基因，并且可以针对特定细胞类型进行修饰，但其转染效率较低，并且由于整合位点的随机性，可能会导致不可预测的安全性问题。
3. 腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）腺相关病毒是一种非致病的病毒，其在人体中广泛分布。
AAV具有良好的基因传递能力和安全性。
它能够传递较短的基因序列，并能够长期稳定地表达基因。
然而，由于AAV的包装能力有限，其传递能力受到一定的局限。
二、非病毒载体相比病毒载体，非病毒载体在基因传递中具有更好的安全性和更低的免疫反应。
然而，非病毒载体传递效率较低，需要优化。
1. 基因枪（Gene gun）基因枪是一种通过加速金属微粒来传递DNA或RNA的方法。
它能够有效传递基因到细胞中，并且不受基因大小的限制。
尽管基因枪具有卓越的穿透性和稳定性，但它的应用仍然受到技术要求和操作复杂性的限制。
2. 转染剂（Transfection reagents）转染剂是基因治疗中常用的非病毒载体。
基因治疗时代到来：常用基因治疗载体的介绍与选择
其中γ-逆转录病毒载体最早被改造的且广
例如使用逆转录病毒载体治疗的10
X连锁重度复合型免疫缺陷病(X-SCID)患者中，有4例因
LMO2等的附近，激活下游基因的表达
JEB后，研究团队通过全基因测序确定了插入位
发现有27000多个插入位点，但基本都集中在非编码序
LV）：以HIV-1（人
I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。属
AdV）：无包
DNA病毒，腺病毒载体宿主细胞范围广泛，
。不足之处：①
18岁少年Jesse Gelsinger在接受Jim
教授主导的腺病毒（AdV）的临床治疗中，因强烈的
4），此后Wilson教授找到了更适合更安
AAV）。腺相
AAV）：目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺
痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体等，由于使用较少，
4--Jesse Gelsinger（图左），Jim Wilson
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
最简单的非病毒载体是裸DNA，可直接注入特
DNA有着较为广泛的应用。以及近期异军
BioWorld专门做过解读，详情
CAR-T新策略：纳米颗粒携带CAR载体在体内
CAR-T细胞。非病毒载体虽然有着诸多优点，但也存
。2017年，
1）。图1
年11月2日，NEJM发表论文：Single-Dose
，
9型（AAV9）为载体的基因疗法成功延长了
位1型脊髓性肌萎缩症（SAM1）患儿的生命（图2）。图
年8月30日，诺华公司治疗B细胞急性淋巴细胞白
CAR-T疗法Kymriah获FDA批准
FDA批准的第一款基因疗法（图3）。图3以上
RV）、腺相关病毒（AAV）、慢病毒
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。
基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。
近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。
由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。
慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。
病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。
目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。
慢病毒载体构建 Protocol
慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。
下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。
2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。
3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。
4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。
5.限制性内切酶：用于DNA切割。
6.DNA连接酶：用于DNA连接。
7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。
8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
9.细胞培养基：用于细胞培养。
10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。
11.抗生素：用于防止细胞污染。
12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。
二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。
2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。
3.水浴锅：用于保温反应液。
4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。
5.细胞培养箱：用于细胞培养。
6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。
7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。
8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。
9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。
三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。
2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。
3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。
6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。
慢病毒载体-是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统
慢病毒载体-是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统慢病毒载体-是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。
学术术语来源——慢病毒介导重组质粒转染兔下颌骨骨髓间充质干细胞文章亮点：1 慢病毒载体感染骨髓间充质干细胞之后，外源基因能够整合到宿主细胞基因组中，而且能持久地表达。
慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。
2 实验所应用的慢病毒载体属于“第3代”慢病毒载体，其基因组的3’LTR 的增强子功能发生了缺失，从而形成了所谓的“自灭活”(Self-inactivation，SIN)，即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有较好的安全性。
关键词：干细胞；骨髓干细胞；下颌骨；骨髓间充质干细胞；神经生长因子；慢病毒；基因转染；国家自然科学基金主题词：骨髓；间质干细胞；下颌骨；神经生长因子；慢病毒感染摘要背景：中枢或周围神经系统损伤是临床中常见的问题，且治疗效果尚不理想。
神经生长因子在神经元细胞损伤修复和生长发育方面具有重要作用，但局部应用的神经生长因子存在易于失活、流失的缺点。
目的：旨在通过慢病毒载体构建人神经生长因子β重组质粒，转染荧光兔下颌骨骨髓间充质干细胞并研究其生物学活性。
方法：采用慢病毒作为载体，经Hin d Ⅲ+NotⅠ双酶切法构建含目的基因的pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP质粒。
分离和培养兔下颌骨骨髓间充质干细胞，经重组质粒转染后，应用酶联免疫吸附法检测骨髓间充质干细胞分泌人神经生长因子β的情况。
结果与结论：成功构建了pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP真核表达载体，经酶切鉴定和测序均证明质粒构建完整、正确。
质粒转染后兔下颌骨骨髓间充质干细胞在荧光显微镜下可以发出绿色荧光，且荧光强度不随培养时间延长而衰退。
基因治疗中常用的载体类型及特点
基因治疗中常用的载体类型及特点下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。
慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。
本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。
首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。
慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。
因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。
其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。
常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。
而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。
此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。
总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。
通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。
慢病毒载体的详细介绍
慢病毒载体的详细介绍病毒是一种生物制剂，其在感染时可以有效地将其遗传物质引入靶细胞，并依赖宿主细胞进行复制。
载体可以携带目的基因进入细胞，代替野生型病毒基因。
因此，非复制载体缺乏在细胞中自我繁殖的遗传信息，但仍保留向靶细胞引入目的基因的能力。
慢病毒（LV）属于逆转录病毒家族（逆转录病毒，慢病毒属）。
LV是目前最实用的基因载体，也是基因治疗应用中重要的研究工具，因为其可以感染细胞并使携带的基因整合到基因组上长期稳定的表达。
人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）可能是已经研究的慢病毒中最适用的，虽然其致病性早就被人们所知，但是艾滋病病毒衍生的载体载基因治疗中的应用越来越受到人们关注，尤其是其在分化和不分裂的细胞的研究。
此，已经有相当多的研究致力于设计具有更高生物安全特性的LV。
此外，非基因治疗LV的应用也得到了广泛的研究，包括基于RNA干扰的哺乳动物细胞稳定基因敲除的基因功能的研究。
虽然在实验研究中使用LV可能更倾向于它们的功能特性，包括提高生产力和/或转染效率，但更安全的载体的设计有助于提高实验的安全性。
LV被认为是重组病毒，还是细胞转染工具LV，这主要可能取决于涉及活动的目的或类型的若干监管规定和指导方针。
在使用LV时，相关法规、指南做出了规定：（i）在工作场所，保护工人远离生物制剂暴露的风险；（ii）操作规范，正确谨慎处理转基因释放的（微）生物体或生物体含有重组DNA分子；（iii）保证人或兽用生物制品和药品的安全性，如使用LV的人员和LV转染的细胞虽然用于治疗目的的LV或慢病毒转导细胞的使用产生了一些重要的问题包括质量、疗效、安全性、伦理、社会和监管问题，但是本次探讨的范围是限于LV在研究活动的生物风险评估。
我们的目标是概述目前用于改善载体生物安全的不同策略，并比较最新的慢病毒包装系统。
虽然这次探讨的重点是由单独的载体构成的危险，但是我们也认识到LV风险评估也应考虑到与转基因相关的危害。
在LV中克隆癌基因或使shRNA介导的肿瘤抑制基因的敲除显然是需要严格的生物安全措施实施的高风险操作。
慢病毒载体基因治疗方法在遗传学研究中的应用前景
慢病毒载体基因治疗方法在遗传学研究中的应用前景引言：遗传学是生物学的重要分支领域，研究生物体的遗传变异、遗传原理和遗传规律。
随着科学技术的迅猛发展，慢病毒载体基因治疗方法在遗传学研究中日益受到关注。
慢病毒载体基因治疗方法具有高效的转导效率、长期稳定性和较低的免疫反应，而且能够治疗一些难以治愈的遗传性疾病。
本文将介绍慢病毒载体基因治疗方法在遗传学研究中的应用前景。
一、慢病毒载体基因治疗方法的原理和特点慢病毒载体基因治疗方法是一种利用慢病毒作为基因传递工具的遗传治疗技术。
慢病毒是一种可以将外源基因稳定地整合到宿主基因组中的病毒。
其传染性强、载体容量大、整合稳定等特点使得慢病毒成为理想的基因治疗载体。
慢病毒载体基因治疗方法通过将需要表达或修复的基因导入到慢病毒中，再通过慢病毒感染宿主细胞，将基因转导入宿主细胞基因组，实现基因的表达或修复。
该方法具有如下几个重要特点：高效的转导效率、长期稳定性、可以整合到细胞基因组中、载体容量大、适用于不同类型的细胞和组织、较少的免疫反应等。
这些特点使得慢病毒载体基因治疗方法在遗传学研究中具有广阔的应用前景。
二、慢病毒载体基因治疗方法在遗传学研究中的应用1. 研究基因功能慢病毒载体基因治疗方法可以用于研究各种基因的功能和调控机制。
通过将具有特定功能的基因载入慢病毒并转导入目标细胞中，可以观察该基因在细胞内的具体功能以及其调控的信号通路。
2. 模拟人类遗传疾病慢病毒载体基因治疗方法可以用于构建模拟人类遗传疾病的动物模型。
将人类遗传疾病相关基因突变转导到小鼠等模型动物体内，可以观察疾病的发生和发展过程，从而深入理解遗传疾病的机制。
3. 基因修复慢病毒载体基因治疗方法可以用于修复基因突变引起的遗传疾病。
通过将正常的基因导入到慢病毒中，再将其转导入患者的细胞中，可以修复基因突变并恢复正常的基因功能。
4. 基因敲除和基因静默慢病毒载体基因治疗方法可以利用RNA干扰技术实现基因敲除和基因静默。
慢病毒噬菌体的研究及其在基因治疗中的应用
慢病毒噬菌体的研究及其在基因治疗中的应用慢病毒噬菌体（lentivirus）是一类具有高度感染力和广泛的靶细胞范围的病毒。
这种病毒最早是在20世纪50年代被发现的。
近年来，随着基因治疗技术的不断发展，慢病毒噬菌体在基因治疗中的应用逐渐被人们所关注和研究。
本文将介绍慢病毒噬菌体的结构和感染机制，探讨慢病毒噬菌体在基因治疗中的应用。
慢病毒噬菌体的结构和感染机制慢病毒噬菌体是一种具有杆状外壳的病毒，其外壳由核盖（capsid）和膜蛋白（envelope）组成。
在核盖内部，慢病毒噬菌体含有一个单链RNA（ssRNA）基因组。
这个基因组由三个基因编码区域组成，分别是Gag、Pol和Env。
Gag编码区域编码一系列蛋白质，包括Capsid、Matrix和Nucleocapsid等，这些蛋白质可以组成病毒的核盖；Pol编码区域编码一系列酶，包括反转录酶（reverse transcriptase）、核酸酶（nuclease）等，这些酶可以帮助病毒合成DNA基因组；Env编码区域编码一系列蛋白质，包括膜蛋白等，这些蛋白质可以组成病毒的膜外层。
慢病毒噬菌体的感染是通过与细胞表面上的一种特定的受体结合实现的，这个受体被称为CD4。
CD4受体是人体免疫系统的一部分，主要存在于T细胞表面。
当慢病毒噬菌体进入机体时，它会通过与T细胞表面的CD4受体结合，进入细胞内部。
在细胞内部，病毒的ssRNA基因组会被反转录酶催化，转化为DNA基因组，然后再通过核糖体的帮助，融合到宿主细胞的基因组中，从而形成一个新的复合基因组。
这个复合基因组可以通过细胞分裂等方式复制自身，这样，慢病毒噬菌体就能在宿主细胞内长期存在，从而引起一系列疾病。
慢病毒噬菌体在基因治疗中的应用慢病毒噬菌体由于具有高度感染力和广泛的靶细胞范围，在基因治疗中得到了广泛的应用。
它可以用来将外源性基因转化为DNA序列，并将其导入到患者的细胞内，从而实现基因治疗。
具体应用如下：1. 慢病毒噬菌体在癌症治疗中的应用癌症是现代社会中一个重要的疾病，其治疗一直是医学领域的一个难点。
慢病毒载体在基因治疗中的应用前景
慢病毒载体在基因治疗中的应用前景随着科技的飞速发展，基因修复技术被广泛运用于人类疾病治疗。
然而，直接将基因修复剂传递到人体内，其危险性和有效性仍是一个开放性问题。
因此，研究人员开始探索利用慢病毒载体作为基因治疗的有效手段。
本文将探讨慢病毒载体在基因治疗中的应用前景。
一、慢病毒载体的特点慢病毒是一种非致命性病原体，具有以下特点：1. 可以将自己的RNA融入宿主DNA中；2. 在宿主体内存在较长时间，细胞内繁殖速度缓慢；3. 安全性高，转导范围广。
这些特点使得慢病毒载体成为基因治疗的潜在治疗手段。
二、慢病毒载体在基因治疗中的应用慢病毒载体在基因治疗中的应用主要有两种方式：直接将慢病毒载体注入人体、将基因修复剂嵌入慢病毒载体中单独注入人体。
前者可直接降低基因修复剂与宿主细胞的反应率，后者则可以提高基因修复剂的转导效率。
三、慢病毒载体的优势1. 转导范围广慢病毒载体可以在众多类型的细胞中高效转导，包括胚胎干细胞、造血干细胞及其分化的各种成分，机体多种组织和器官中的多种细胞，如心肌细胞、肝细胞、肌肉细胞、神经系统细胞等。
2. 转导效率高慢病毒载体能将外源基因表达至持续接近宿主细胞内基因治疗领域的观察时间。
在满足适当条菌感染条件下，慢病毒载体可以完成相对完整的外源基因整合进宿主细胞某个区域的整合，也可以在细胞内产生高效或稳定的外源基因表达。
3. 病毒相关疾病风险低慢病毒载体基本上不会导致肿瘤形成。
实验证明，慢病毒载体直接接触人体的作用时具有安全性，病毒产生病毒相关性疾病的风险较小。
由于慢病毒载体生长速度缓慢，造成病毒感染的风险也随之降低。
四、慢病毒载体的挑战1. 载体突变率高慢病毒载体在传播或整合到人体自身细胞时，由于长链RNA的复制过程，会出现一定的错误率。
这可能导致慢病毒载体突变，并产生与其本身不同的药物适应性。
2. 抗体的干扰人体对于外源病毒的抵抗力使得慢病毒载体越来越难以进入细胞。
一些慢病毒载体会被人体产生抗体排除，那么它的疗效就会大大降低。
慢病毒载体-是以HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体
慢病毒载体-是以HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
对分裂细胞和非分裂细胞比以往的反转录病毒载体感染效率更高慢病毒载体-是以HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
对分裂细胞和非分裂细胞比以往的反转录病毒载体感染效率更高。
学术术语来源---携带CXCR4基因慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验文章亮点：1细胞上清分泌蛋白是干细胞在体内修复组织损伤、调节免疫功能的主要手段。
研究提示转染CXCR4的骨髓间充质干细胞可以分泌更多的免疫调节蛋白，对治疗免疫性疾病有重要意义。
2转染CXCR4的骨髓间充质干细胞凋亡率下降、细胞多处于增殖期，提示过表达CXCR4的间充质干细胞除了趋化能力改变外，细胞生长特性也受到影响。
关键词：干细胞；骨髓干细胞；慢病毒；骨髓间充质干细胞； CXCR4；细胞增殖；免疫调节因子；辽宁省自然科学基金主题词：骨髓；间质干细胞；慢病毒属；受体，CXCR4摘要背景：间充质干细胞在体内归巢主要调控因子是CXCR4，如何提高干细胞自身CXCR4的表达量是调节干细胞体内靶器官归巢能力的关键。
目的：构建CXCR4或GFP基因慢病毒表达载体，并观察其对骨髓间充质干细胞自身生长特性及分泌功能的影响。
方法：骨髓间充质干细胞应用慢病毒载体转染系统转染CXCR4基因达到过表达，同时单独转GFP基因作为对照。
通过荧光显微镜、RT-PCR、免疫蛋白印迹方法验证病毒转染效率；流式细胞技术测定骨髓间充质干细胞的增殖、凋亡情况；Western Blot法测定间充质干细胞培养基上清中分泌蛋白及细胞因子变化。
结果与结论：慢病毒转染系统可以安全、有效地转染CXCR4基因或GFP基因到骨髓间充质干细胞。
流式细胞仪检测显示过表达CXCR4的骨髓间充质干细胞增殖能力、生存能力加强，凋亡细胞减少(P < 0.05)；细胞上清蛋白分析提示过表达CXCR4后，骨髓间充质干细胞培养上清内出现很多的蛋白因子升高(P < 0.05)，其中大多数对细胞自身复制及免疫调节有益。
哺乳动物基因表达慢病毒载体
哺乳动物基因表达慢病毒载体
慢病毒载体系统是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。
除了常规质粒转染外，目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。
由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点，使得慢病毒载体系统成为倍受欢迎的外源基因表达系统。
慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。
野生型慢病毒基因组是线性双正链RNA。
慢病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。
在包装细胞中，位于两个长末端重复序列（LTR）之间的DNA片段会被转录成RNA，由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。
包装后的活体病毒将会被释放到上清液中，可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。
当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。
在病毒载体中，位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。
pLVX-DD-AmCyan1 Reporter慢病毒载体使用说明
pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-AmCyan1 Reporter载体基本信息：载体名称:pLVX-DD-AmCyan1 Reporter质粒类型: 慢病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: 无载体大小: 8494 bp5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: 青色荧光蛋白DD-AmCyan1载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 嘌呤霉素（Puromycin）克隆菌株: Stbl3宿主细胞（系）: 常规细胞系，293、CV-1、CHO等备注: pLVX-DD-AmCyan1 Reporter载体没有启动子；DD-AmCyan1与AmCyan1相比，N端融合了ProteoTuner destabilization domain (DD)去稳定结构域，导致AmCyan1在细胞内很快被蛋白酶降解，降低了背景荧光，是研究启动子活性的理想报告基因。
稳定性: 稳表达组成型/诱导型: --病毒/非病毒: 慢病毒pLVX-DD-AmCyan1 Reporter载体质粒图谱和多克隆位点信息：pLVX-DD-AmCyan1 Reporter载体简介：pLVX-DD-AmCyan1 Reporter is a promoterless reporter vector that allows the functional analysis of different promotersand promoter/enhancer combinations inserted into its multiple cloning site (MCS). The vector encodes the reporter proteinDD-AmCyan1, a ligand-dependent, destabilized cyan fluorescent protein that minimizes background fluorescence fromleaky promoters. A promoter must be cloned into the MCS, located upstream of the DD-AmCyan1 coding sequence.Without the addition of a functional promoter, the vector will not expressDD-AmCyan1.Location of Features5' LTR: 1–635PBS (primer binding site): 636–653Ψ (packaging signal): 685–822RRE (Rev-response element): 1303–1536cPPT/CTS (central polypurine tract/central termination sequence): 2028–2151MCS (multiple cloning site): 2195–2234DD (FKBP-L106P destabilization domain): 2247–2570AmCyan1 (Anemonia majano cyan fluorescent protein): 2577–3263PPGK (phosphoglycerate kinase promoter): 3274–3782Puror(puromycin resistance gene): 3803–4402WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element): 4416–5007 3' LTR: 5211–5847pUC origin of replication: 6317–6987 (complementary)Ampr(am picillin resistance gene; β-lactamase): 7132–8128 (complementary)pLVX-DD-AmCyan1 Reporter载体序列pLVX-DD-AmCyan1 Reporter其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAGpMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRCpCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMSFUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherrypLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miRpCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-PuropLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK PuropLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。
用于基因治疗的慢病毒载体(一)
用于基因治疗的慢病毒载体(一)基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最大障碍。
非病毒学的基因转移方法效率较低；已用于人体试验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。
常用的逆转录病毒载体从小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，目前主要用于基因治疗的离体方案；腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导；其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意。
理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。
近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。
研究表明〔1-5〕，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。
本文即对该类载体的研究进展做一简介。
1HIV-1基因组的基本结构〔6〕HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5＇LTR-gag-pro-pol-env-3＇LTR。
其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。
与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。
一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体[发明专利]
![一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/0e0dd72d77c66137ee06eff9aef8941ea66e4b71.png)
专利名称：一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体专利类型：发明专利
发明人：凌思凯,汪啸渊
申请号：CN202210101205.3
申请日：20220127
公开号：CN114317610A
公开日：
20220412
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体；其包装质粒包括表达包膜蛋白的pMD.2G，表达REV蛋白的pRSV‑REV，整合酶突变失活的pMDlg/pRRE‑INmut或
pMDlg/pRRE，和表达TH、AADC和CH1的载体质粒。
本发明提供了2种慢病毒载体递送外源基因，一种是具有基因整合作用的慢病毒载体，另一种是非整合型慢病毒载体；都将目的基因递送到细胞中长期表达蛋白；整合型慢病毒载体将所递送的外源基因整合至基因组中，在细胞扩增后依然可以稳定表达蛋白；非整合型慢病毒载体将所递送的外源基因游离于基因组外，不干扰宿主基因组，在终末分化的细胞内可以长期存在，并表达蛋白。
申请人：上海本导基因技术有限公司
地址：201100 上海市闵行区都会路1699号17幢B单元301、302、303、304室
国籍：CN
代理机构：上海段和段律师事务所
代理人：王丹东
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用于基因治疗的慢病毒载体(一)
基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最大障碍。
非病毒学的基因转移方法效率较低；已用于人体试验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。
常用的逆转录病毒载体从小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，目前主要用于基因治疗的离体方案；腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导；其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意。
理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。
近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。
研究表明〔1-5〕，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。
本文即对该类载体的研究进展做一简介。
1HIV-1基因组的基本结构〔6〕
HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5＇LTR-gag-pro-pol-env-3＇LTR。
其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。
与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。
非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。
这些基因的编码产物都有各自的功能，有些尚未完全阐明，在此不一一赘述。
2构建HIV-1载体系统的基本原理〔7〕
HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5＇LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3＇LTR换成SV40polyA等。
包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。
图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种〔1〕。
将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
3HIV-1载体系统的改进
近年来，已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力〔8〕、筛选抗病毒药物〔9〕、评价Env糖蛋白的不同区域在介导病毒进入细胞中的作用〔10〕等。
而目前对于以基因治疗为目的的HIV-1载体系统，研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提供其滴度和转导能力上。
1996年以来，Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓舞的研究结果〔1～3〕，主要包括以下几方面的改进。
3.1包膜蛋白
最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。
1996年，Trono课题组的Naldini等〔1〕设计的HIV-1载体系统(见图1)采用表达水疱性口炎
病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。
这样做的结果至少具有三个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。
Naldini等已使HIV-1载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。
这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。
3.2包装成分
包装成分的构建应在不影响重组病毒的装配和感染力的前提下，尽可能地减少无关的HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的恢复设置障碍。
Naldini等〔1，2〕在构建包装质粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2时，分别在env基因阅读框架前插入了多个终止密码子或删除了env基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以阻止env基因的表达。
在此基础上，Zufferey等〔3〕将包装包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对于产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导非分裂细胞的能力。
这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素〔11，12〕，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。
3.3载体质粒
载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。
此外，研究表明〔7〕，gag基因5＇端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。
因此，Naldini等〔1～3〕在载体上保留了gag基因5＇端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。
对于载体上需含有多少顺式作用序列为最佳，目前尚不完全靖楚。
4HIV-1载体介导基因转移的体内外实验
迄今，Trono课题组构建的HIV-1载体系统已在体外转导过人子宫颈癌细胞(HeLa)、鼠成纤维细胞(208F)、原代培养的人巨噬细胞、人呼吸道上皮细胞等，结果表明〔1-5〕，HIV-1载体无论对分裂细胞还是非分裂细胞均能转导，但对非分裂细胞的转导效率与细胞所停止的周期有关。
HIV-1载体对G0期细胞的转导效率不如对静止于G1/S或G2期的效率高，停止于G0期的时间越长，这种差别越大。
这可能是由于某些G0期细胞内脱氧核苷酸浓度低、影响了反转录步骤，造成报告基因未表达所致的表观现象。
实际上，HIV-1载体有的已进入到G0期的靶细胞内，建立了转录中间体。
一旦这类细胞进入细胞周期，载体所携带的基因就会表达。
在动物体内实验中，Naldini等〔1〕将HIV载体注射成年大鼠脑组织，30天后取脑组织，未观察到病理变化，免疫组化显示报告基因能够在终末分化的神经元中表达，证明HIV载体对体内基因转移是有效的。
此后，他们将重组病毒在转导前用dNTP和多胺处理，以增加病毒内逆转录反应，可使对大鼠神经元的转录数率提高2倍，报告基因可表达3个月以上〔2〕。
Miyoshi等〔4〕将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的HIV载体注射大鼠眼球，GFP能在感光细胞和视网膜色素细胞中表达，如果以视紫质启动子控制GFP，则可在感光细胞中特异地高表达。
对于HIV-1载体进入非分裂细胞后的表达是否全部由整合形式产生，目前尚有不同意见。
Naldini等〔2〕将包装质粒中的整合酶基因突变，如此而产生的HIV载体不能在非分裂细胞中表达，因此认为HIV载体的表达全部由整合形式产生；而Goldman等〔5〕却在转导细胞中测到了HIV载体前病毒的非整合形式，认为不能排除两种形式同时存在的可能。
在用HIV-1载体已经进行的所有体内外实验中〔1～5〕，未出现过有复制力的HIV，说明其安全性是有保证的。