PH0630 活性氧检测试剂盒实验操作手册 Phygene
活性氧的检测方法
活性氧的检测方法摘要活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是一类在细胞内广泛存在且具有高度活性的分子。
活性氧对细胞膜、蛋白质和核酸等生物分子造成损伤，并参与了多种生物学过程。
因此，准确测量活性氧的水平对于揭示其生物学功能以及相关疾病的发生机制具有重要意义。
本文将介绍几种常见的活性氧检测方法，并对其优缺点进行讨论。
1. 化学染料法化学染料法是一种简单、直观的活性氧检测方法。
目前常用的化学染料包括二苯基四氮唑盐 (DAB)、硝基蓝色苯胺盐 (NBT)和氧化铁氰化钠 (FeCN) 等。
这些染料可与活性氧发生特异性反应，并在反应过程中产生可定量分析的颜色变化。
然而，化学染料法存在一些局限性。
首先，染料的选择与操作条件对实验结果有很大影响，如pH值、温度等。
其次，该方法只能提供活性氧的总量，而无法分辨各种活性氧物种的相对含量。
此外，由于染料具有较强的选择性，所检测的活性氧种类也较为有限。
因此，在应用化学染料法时需要小心考量其适用性。
2. 荧光探针法荧光探针法是一种广泛应用于活性氧测定的方法。
该方法利用已知产生荧光信号的探针与活性氧发生特异性反应，通过测量荧光信号的强度来间接测定活性氧的水平。
常见的荧光探针包括二苯基巴比妥酸 (DABCO)、二羟基联苯 (DPBF) 和二苯并硼菊酯 (DCFH-DA) 等。
这些荧光探针表现出高度选择性和灵敏性，可以用于监测不同活性氧物种的生成和消除动力学过程。
然而，荧光探针法也存在一些限制。
例如，某些荧光探针可能因自身的不稳定性而导致误差。
此外，荧光信号的测量需要专业设备的支持，且荧光信号也易受环境因素的影响。
因此，在选择荧光探针时需要根据实际需求进行权衡。
3. 电化学法电化学法是一种可探测活性氧的敏感、定量且实时的方法。
该方法是通过将活性氧还原为可测电流来测定其浓度。
电化学法常用的电极包括铂电极、碳电极和金电极等。
电化学法的优势在于其高灵敏度、实时性和可定量性。
活性氧检测试剂盒 说明书
活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit
货号：CA1410
规格：100-500T
产品内容：
10 mM DCFH-DA in DMSO 活性氧供体 说明书
0.1 ml 1 ml 1份
20 ºC 保存 20 ºC 保存
产品简介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化
物(O2•−, H2O2, •OH, ONOO−, •NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过
程。采用 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用也是较灵敏的细胞内活性氧检探针。
DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时 DCFH 被氧化
3. PBS 洗涤细胞 2 次。 三、荧光检测
采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧 光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每 10 分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细 胞仪可将细胞用胰酶消化 PBS 洗涤后重悬检测。
1. 加入 DCFH-DA 于培养基，推荐初始工作浓度为 10 µM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA 工作浓度可 为 100 nM~20 µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 对细胞 的影响。以 DMSO 作为溶剂对照。
2. 37 ºC 孵育细胞 30min~至几个小时，通常 30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、 DCFH-DA 浓度有关。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
NADH氧化酶（NOX）活性检测试剂盒说明书
NADH氧化酶（NOX可见分光光度法货号：BC0630规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体25 mL×1瓶4℃保存试剂二液体5 mL×1瓶4℃保存试剂三液体0.5 mL×1支-20℃保存试剂四液体70 mL×1瓶4℃保存试剂五液体10 mL×1瓶4℃保存试剂六粉剂×2瓶-20℃保存溶液的配制：试剂六：临用前加入9 mL双蒸水，用不完的试剂-20℃分装保存。
产品说明：NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD+。
该酶不仅参与NAD+的再生，而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD+，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1.准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆600g，4℃离心5min。
将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
3.将上清液转移至另一EP管中，即胞浆提取物，用于线粒体中泄露NOX活性测定。
4.沉淀即为线粒体，加入200µL试剂二和2µL试剂三，反复吹打充分混匀，用于NOX活性测定，并用于蛋白浓度测定。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一个广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的有害物质，在细胞内氧化还原反应中扮演重要角色。
活性氧包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，具有强氧化性。
活性氧在正常细胞代谢和维持细胞信号传导途径中发挥重要作用，但在细胞内过量生成会对细胞结构和功能造成损害，引发细胞衰老和死亡，促进炎症反应，以及导致一系列疾病的发生，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。
活性氧检测是研究活性氧与细胞过程和疾病发生关系的重要手段。
常用的活性氧检测方法包括荧光探针染色法、电子自旋共振（electronspin resonance，ESR）法、流式细胞仪法、化学法等。
下面是一种基于荧光探针的活性氧检测实验方案，具体步骤如下：材料：1.细胞培养样本（如细胞系或原代细胞）2.活性氧检测荧光探针（如2',7'-二氯二羟苯基-4'-巯基吡啶，DCFH-DA）3.PBS（磷酸缓冲盐溶液）4.离心管5.无菌1.5mL离心管6.显微镜玻片7.荧光显微镜8.细胞培养基实验步骤：1.把细胞培养在合适的培养基中，保持在37°C的恒温培养箱中，条件合适时使其达到对照组的80%～90%接种度。
2.将细胞分装到离心管中，每支40mL细胞悬液。
3.加入DCFH-DA溶液，终浓度为10mM，使细胞充分吸收荧光探针。
将培养管放入37°C恒温培养箱中孵育30分钟以进行探针进入细胞。
4.将细胞洗涤剂去除，用PBS洗涤细胞3次以除去多余探针。
5.加入1mL的PBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中，以进行离心。
去除上清液，避免细胞牵涉。
6.加入1.5mLPBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中离心，去除上清液。
7.将取得的细胞悬液滴在显微镜玻片上，并加盖玻片。
在荧光显微镜下观察细胞活性氧的荧光信号强度。
细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书(中文版)
细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细菌氧化条件下，产生荧光，来定量检测细菌活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种实验用细菌菌株氧化应激活性氧的分析。
产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。
技术背景细菌作为模式生物，是环境化学毒性研究的常用工具。
活性氧的检测可以用于诸如多环芳烃化合物或重金属的毒性作用以及修复（remediation）的评价指标。
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。
氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。
仪器操作规程-pH酸度计仪器设备使用说明书精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版
pH酸度计仪器设备使用说明书
1、检查仪器的使用环境。
检查内容包括实验室是否清洁、仪器放置的平台是否稳固、阳光是否直射、温湿度范围是否合理等。
2、检查仪器外观是否完整、有误破损之处。
3、清洁仪器外观。
4、检查复合电极不用时，是否充分浸泡3M氯化钾溶液中。
切忌用洗涤液或其他吸水性试剂浸洗。
5、开机试运行，使用前，检查玻璃电极前端的球泡。
正常情况下，电极应该透明而无裂纹；球泡内要充满溶液，不能有气泡存在。
预热30分钟。
检查运行状态是否正常。
6清洗电极后，不要用滤纸擦拭玻璃膜，而应用滤纸吸干, 避免损坏玻璃薄膜、防止交叉污染，影响测量精度。
7. 检查pH 玻璃电极的贮存环境，建议条件如下：短期贮存在pH＝4 的缓冲溶液中；长期贮存在pH＝7的缓冲溶液中。
8、使用完后pH 玻璃电极的清洗玻璃电极球泡受污染可能使电极响应时间加长。
可用CCl4 或皂液揩去污物，然后浸入蒸馏水一昼夜后继续使用。
污染严重时，可用5％HF 溶液浸10～20 分钟，立即用水冲洗干净，然后浸入0.1N HCl 溶液一昼夜后继续使用。
9、检查玻璃电极是否老化，若老化可以用氢氟酸浸蚀掉外层胶层，经常能改善电极性能。
若能用此法定期清除内外层胶层，则电极的寿命几乎是无限的。
10、检查干燥剂是否有效，若无效进行更换。
氧化应激检测试剂盒使用说明
氧化应激检测试剂盒使用说明氧化应激检测试剂盒北京华越洋生物超氧化物歧化酶测试盒(SOD)超氧化物歧化酶测试盒(SOD)碱性磷酸酶检测试剂盒谷胱甘肽一还原酶测试盒总巯基测试盒/总脂酶测试盒总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法）总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法）总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）总抗氧化能力测试盒（比色法）总谷胱甘肽检测试剂盒总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒总SOD活性检测试剂盒（WST法）总SOD活性检测试剂盒（NBT法）脂质氧化（MDA）检测试剂盒脂褐质测试盒游离脂肪酸测试盒抑制与产生超氧阴离子自由基测试盒（比色法）乙酰胆碱转移酶测试盒乙酰胆碱酯酶测试盒一氧化氮检测试剂盒（硝酸还原酶法）一氧化氮检测试剂盒（化学法）一氧化氮合成酶测试盒胃蛋白酶测试盒维生素C测试盒微量丙二醛测试盒/脂质过氧化物测试盒唾液酸测试盒（带SA标准）糖化血清蛋白测试盒（果糖胺法）（带标准）胎盘碱性磷酸酶检测试剂盒酸性磷酸酶检测试剂盒神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒神经氨酸酶检测试剂盒乳酸脱氢酶测试盒乳酸测试盒（测血清、组织等）乳酸测试盒（测全血）醛缩酶测试盒羟脯氨酸测试盒（消化法）（测培养细胞、培养液）羟脯氨酸测试盒（碱水解法）（测动物血清、组织、尿液）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测试盒抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒抗氟离子酸性磷酸酶检测试剂盒肌酸激酶测试剂盒活性氧检测试剂盒活性氧（羟自由基）测试盒（比色法）琥珀酸脱氢酶测试盒红细胞NADH高铁血红蛋白还原酶测试盒过氧化氢酶测试盒（可见光比色法）过氧化氢定量分析试剂盒（脂兼容性）过氧化氢定量分析试剂盒（水兼容性）过氧化氢测试盒谷胱甘肽还原酶检测试剂盒谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒谷氨酰胺测试盒肝/肌糖元测试盒钙调神经磷酸酶测试盒蛋白去除试剂S蛋白去除试剂M胆碱酯酶测试盒超氧化物试剂盒超微量ATP酶测试盒（可测总ATPase）超微量ATP酶测试盒（测Na+ K-ATPase）超微量ATP酶测试盒（测Ca2+ Mg2+ ATPase）超微量ATP酶测试盒（测Ca2+ ATPase）超微量ATP酶测试盒（Na+ K+、Ca2+ Mg2+ ATPase）丙二醛测试盒/脂质过氧化物测试盒ROS活性氧检测试剂盒NF-κB激活－核转运检测试剂盒H5N1神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒GSH试剂盒（谷胱甘肽测试盒）（比色法）GSH—PX测试盒GSH—ST测试盒Catalase（抗氧化酶）GSH和GSSG试剂盒CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒（WST法）ATP酶测试盒（组织及细胞膜需高速离心）ATP酶测试盒（组织及细胞膜不需高速离心）ATP检测试剂盒。
人活性氧簇酶联免疫分析试剂盒使用说明书
人活性氧簇酶联免疫分析试剂盒使用说明书检测范围：96T0.3ng/mL - 8ng/mL使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中活性氧簇（ROS）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人活性氧簇（ROS）水平。
用纯化的人活性氧簇（ROS）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入活性氧簇（ROS），再与HRP 标记的活性氧簇（ROS）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的活性氧簇（ROS）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人活性氧簇（ROS）浓度。
试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（16ng/mL） 0.5ml×1 瓶3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
8ng/mL 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液4ng/mL 4 号标准品 150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液2ng/mL 3 号标准品 150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液1ng/mL 2 号标准品 150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液0.5ng/mL 1 号标准品 150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。
ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。
然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。
为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。
以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。
b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。
2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。
b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。
3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。
b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。
c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。
总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。
这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。
活性氧定量试剂盒说明
Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay KitCatalog no. A22188Contents and storage information.Table 1.IntroductionThe Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit contains a sensitive, one-stepassay that uses the Amplex® Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) to detecthydrogen peroxide (H2O2) or peroxidase activity. The Amplex® Red reagent, in combinationwith horseradish peroxidase (HRP), has been used to detect H2O2 released from biologicalsamples, including cells,1–4 or generated in enzyme-coupled reactions.5–7 Furthermore,Amplex® Red reagent can be used as an ultrasensitive assay for peroxidase activity when H2O2is in excess.In the presence of peroxidase, the Amplex® Red reagent reacts with H2O2 in a 1:1stoichiometry to produce the red-fluorescent oxidation product, resorufin.1 Resorufinhas excitation and emission maxima of approximately 571 nm and 585 nm, respectively(Figure 1), and because the extinction coefficient is high (58,000 ± 5,000 cm–1M–1), you canperform the assay fluorometrically or spectrophotometrically. This reaction has been used todetect as little as 10 picomoles of H2O2 in a 100 µL volume (50 nM; Figure 2) or1 × 10–5 U/mL of HRP (Figure 3).e x c i t a t i o nFigure 1. Normalized excitation and emission spectra of resorufin, the product of the Amplex® Red reaction.Figure 2. Detection of H 2O 2 using the Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit. Reactions containing 50 µM Amplex® Red reagent, 0.1 U/mL HRP and the indicated amount of H 2O 2 in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, were incubated for 30 minutes at room temperature. Fluorescence was then measured with a fluorescence microplate reader using excitation at 530 ± 12.5 nm and fluorescence detection at 590 ± 17.5 nm. Background fluorescence, determined for a no-H 2O 2 control reaction, has been subtracted from each value. The inset shows the sensitivity of the assay at very low levels of H 2O 2.Figure 3. Detection of HRP using the Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit. Reactions containing 50 µM Amplex® Red reagent, 1 mM H 2O 2 and the indicated amount of HRP in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, were incubated for 30 minutes at room temperature. Fluorescence was then measured with a fluorescence microplate reader using excitation at 530 ± 12.5 nm and fluorescence detection at 590 ± 17.5 nm. Background fluorescence, determined for a no-HRP control reaction, has been subtracted from each value. The inset shows the sensitivity of the assay at very low levels of HRP .Before You BeginUsing the Amplex® Red Reagent The Amplex® Red reagent is air sensitive. Once you open a vial of Amplex® Red, use the • reagent on the same day.The Amplex® Red reagent is unstable in the presence of thiols such as dithiothreitol (DTT) • and 2-mercapto-ethanol. The final concentration of DTT or 2-mercaptoethanol in the reaction should be no higher than 10 µM. The Amplex® Red reagent is also unstable at high pH (>8.5). Furthermore, the fluoroscence excitation and emission of the reaction product, resorufin, are pH-dependent. Below the pK a (~6.0), the absorption maximum shifts to ~480 nm and the fluorescence quantum yield is markedly lower. For these reasons, perform the reactions at pH 7–8. The provided Reaction Buffer is pH 7.4.Protect the Amplex® Red reagent from light • .Allow all reagents in the • Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit to completely warm to room temperature before opening.CautionDMSO is hazardous; avoid contact with skin and eyes and do not swallow. Handle reagents containing DMSO using equipment and practices appropriate for the hazards posed by such materials.Preparing Stock Solutions10 mM Amplex® Red reagent stock solution1.1 Allow one vial of Amplex® Red reagent (Component A, blue cap) and DMSO (Component B, green cap) to warm to room temperature. 1.2 Just prior to use, dissolve the contents of the vial of Amplex® Red reagent in 60 µL of DMSO. Each vial of Amplex® Red reagent is sufficient for approximately 100 assays, with a final reaction volume of 100 µL per assay. Use the Amplex® Red reagent stock solution on the same day it is prepared.1X Reaction Buffer1.3 Add 4 mL of 5X Reaction Buffer (Component C, white cap) to 16 mL of deionized water. This 20 mL volume of 1X Reaction Buffer working solution is sufficient for approximately 100 assays of 100 µL each with 10 mL excess for making stock solutions.10 U/mL Horseradish Peroxidase (HRP) stock solution1.4 Dissolve the contents of the vial of HRP (Component D, yellow cap) in 1.0 mL of 1X Reaction Buffer. After the assay, divide any unused HRP stock solution into single-use aliquots and store frozen at –20°C.20 mM Hydrogen Peroxide (H 2O 2) working solution1.5 Dilute the ~3% H 2O 2 (Component E, red cap) into the appropriate volume of 1X Reaction Buffer. The actual concentration of H 2O 2 is indicated on the label.For instance, you can prepare a 20 mM H 2O 2 working solution from a 3.0% (0.88 M) H 2O 2 stock solution by diluting 22.7 µL of 3.0% H 2O 2 into 977 µL of 1X Reaction Buffer.Note that although the ~3% H 2O 2 stock solution has been stabilized to slow its degradation, the 20 mM H 2O 2 working solution prepared in this step will be less stable and should be used within a few hours of preparation.Stability of SolubilizedReagents We have shown in our laboratory that Amplex® Red, Amplex® UltraRed, and HRP solutionsare stable for at least six months if stored correctly. The recommended storage conditions forthese reagents are minimal exposure to light, air, and freeze thaw cycles. We also recommendusing only high quality and fresh solvents. Despite these measures, we cannot guarantee theirstorage stability. Pink coloring in Amplex® or Amplex® UltraRed reagents is an early indicatorof compromised material.Experimental ProtocolsThe following procedures are designed for use with a fluorescence or absorbance 96-wellmicroplate reader. To use with a standard fluorometer or with different sized microplates,adjust the volumes accordingly.H2O2 Assay The following protocol describes the H2O2 assay in a total volume of 100 µL per microplatewell. The volumes recommended here are sufficient for ~100 assays. The kit providessufficient material for ~500 assays.2.1 Prepare an H2O2 standard curve. Dilute the appropriate amount of 20 mM H2O2 workingsolution (prepared in step 1.5) into 1X Reaction Buffer (prepared in step 1.3) to produceH2O2 concentrations of 0 to 10 µM, each in a volume of 50 µL. Be sure to include a no-H2O2control. Final H2O2 concentrations will be two-fold lower (e.g., 0 to 5 µM).2.2 If you are not using a standard curve, prepare positive and negative controls. For apositive control, dilute the 20 mM H2O2 working solution to 10 µM in 1X Reaction Buffer. Fora negative control, use 1X Reaction Buffer without H2O2.2.3 Dilute the H2O2-containing samples in 1X Reaction Buffer. Use a volume of 50 µL foreach reaction. A variable dilution will be required depending on the total H2O2 present in thesample.In the first trial, serially dilute the samples to determine the optimal amount of sample for theassay. Note that extremely high levels of H2O2 (e.g., 100 µM, final concentration) can producelower fluorescence than moderately high levels (e.g., 25 µM), because excess H2O2 can oxidizethe reaction product, resorufin, to nonfluorescent resazurin.2.4 Load the samples. Pipet 50 µL of the standard curve samples, controls, and experimentalsamples into individual wells of a microplate.2.5 Prepare a working solution of 100 µM Amplex® Red reagent and 0.2 U/mL HRP. Mix thefollowing:•50 µL of 10 mM Amplex® Red reagent stock solution (prepared in step 1.2)•100 µL of 10 U/mL HRP stock solution (prepared in step 1.4)• mL of 1X Reaction Buffer (prepared in step 1.3)4.85This 5 mL volume is sufficient for ~100 assays. Note that the final concentration of eachcomponent will be two-fold lower in the final reaction volume.2.6 Begin the reactions. Add 50µL of the Amplex® Red reagent/HRP working solution to eachmicroplate well containing the standards, controls, and samples.2.7 Incubate the reactions. Incubate at room temperature for 30 minutes, protected fromlight. Because the assay is continuous (not terminated), you may measure fluorescence orabsorbance at multiple time points to follow the kinetics of the reactions.2.8 Measure the fluorescence or absorbance. Use a microplate reader equipped for excitationin the range of 530–560 nm and fluorescence emission detection at ~590 nm (see Figure 1),or for absorbance at ~560 nm.2.9 Correct for background fluorescence or absorbance. For each point, subtract the valuederived from the no-H2O2 control.Measuring H2O2 Releasedfrom Cells You can use the Amplex® Red reagent to detect the release of H2O2 from activated humanleukocytes. To use the Amplex® Red H2O2 assay for this type of experiment, the protocoldevised by Mohanty and colleagues,2 summarized here, may be useful.3.1 Prepare a reaction mixture. The mixture should contain 50 µM Amplex® Red reagent and0.1 U/mL HRP in Krebs–Ringer phosphate. If desired, you can add an activator, such asphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), to the reaction mixture. Each reaction has a volumeof 100 µL.Note: Krebs–Ringer phosphate (KRPG) consists of 145 mM NaCl, 5.7 mM sodiumphosphate, 4.86 mM KCl, 0.54 mM CaCl2, 1.22 mM MgSO4, 5.5 mM glucose, pH 7.35.3.2 Prepare the samples. Pipet 100 µL of the reaction mixture into each microplate well.3.3 Prewarm the reaction mixture at 37°C for ten minutes.3.4 Start the reaction. Add 20 μL of ~1.5 × 104 cells suspended in KRPG buffer to the 100 μLreaction mixture prepared in step 3.1 and warmed in step 3.3. If a negative control isrequired, add 20 μL of KRPG buffer without cells to a separate 100 μL warmed reactionmixture.3.5 Measure the fluorescence. Use a fluorescence microplate reader equipped for excitation inthe range of 530–560 nm and emission detection at ~590 nm, or absorbance at ~560 nm (seeFigure 1).3.6 Return the plate to the incubator. Continue to measure the fluorescence at selected timepoints over the desired time period.Peroxidase Assay The following protocol describes the assay of peroxidase in a total volume of 100 µL permicroplate well. The volumes here are sufficient for ~100 assays. The kit provides sufficientmaterial for ~500 assays.4.1 Prepare a peroxidase standard curve. Dilute the appropriate amount of 10 U/mL HRPstock solution (prepared in step 1.4) into 1X Reaction Buffer (prepared in step 1.3) to produceHRP concentrations of approximately of 0 to 2 mU/mL HRP, each in a volume of 50 µL. Besure to include a no-HRP control. Note that the HRP concentrations will be two-fold lower inthe final reaction volume.4.2 If you are not using a standard curve, prepare positive and negative controls. For apositive control, dilute the 10 U/mL HRP stock solution (prepared in step 1.4) to 2 mU/mL in1X Reaction Buffer (prepared in step 1.3). Use 1X Reaction Buffer without HRP as a negativecontrol.4.3 Dilute the peroxidase-containing samples in 1X Reaction Buffer. Use a volume of 50 µLfor each reaction. A variable dilution will be required depending on the total peroxidasepresent in the sample.In the first trial, serially dilute the samples to determine the optimal amount of sample forthe assay. Note that extremely high levels of HRP (e.g., 100 mU/mL, final concentration) canproduce lower fluorescence than moderately high levels (e.g., 1 mU/mL), because excess HRPcan oxidize the reaction product, resorufin, to nonfluorescent resazurin.4.4 Load the samples. Pipet 50 µL of standard curve samples, controls, and experimentalsamples into individual wells of a microplate.4.5 Prepare a working solution of 100 µM Amplex® Red reagent containing 2 mM H2O2. Mixthe following:•50 µL of 10 mM Amplex® Red reagent stock solution (prepared in step 1.2)• mM H2O2 working solution (prepared in step 1.5)500 µL of 20• mL of 1X Reaction Buffer (prepared in step 1.3)4.45This 5 mL volume is sufficient for ~100 assays. Note that the final concentration of eachcomponent will be two-fold lower in the final reaction volume.4.6 Begin the reactions. Add 50µL of the Amplex® Red reagent/H2O2 working solution to eachmicroplate well containing the standards, controls, and samples.4.7 Incubate the reactions. Incubate at room temperature for 30 minutes, protected fromlight. Because the assay is continuous (not terminated), you may measure fluorescence orabsorbance at multiple time points to follow the kinetics of the reactions.4.8 Measure the fluorescence or absorbance. Use a microplate reader equipped for excitationin the range of 530–560 nm and fluorescence emission detection at ~590 nm (see Figure 1),or for absorbance at ~560 nm.4.9 Correct for background fluorescence or absorbance. For each point, subtract the valuederived from the no-HRP control.References1. Anal Biochem 253, 162 (1997);2. J Immunol Methods 202, 133 (1997);3. J Neurochem 79, 266 (2001);4. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 281, L993 (2001);5. Mol Hum Reprod 7, 237 (2001);6. Anal Biochem 287, 196 (2000);7. J Invest Dermatol 112, 751 (1999).Product List C urrent prices may be obtained from our website or from our Customer Service Department.Cat. no. Product Name Unit Size A22188 Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit *500 assays* ...................................................................................................................... 1 kit Related ProductsA12222 Amplex® Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) .................................................................................................................................... 5 mg A22177 Amplex® Red reagent *packaged for high-throughput screening* ..........................................................................................................................10 x 10 mg A33855 Amplex® Red/UltraRed stop reagent *500 tests* ..............................................................................................................................................................set of 5 vials A36006 Amplex® UltraRed reagent ........................................................................................................................................................................................................ 5 x 1 mg R363 resorufin, sodium salt *reference standard* .......................................................................................................................................................................100 mgContact InformationMolecular Probes, Inc.29851 Willow Creek RoadEugene, OR 97402Phone: (541) 465-8300Fax: (541) 335-0504Customer Service:6:00 am to 4:30 pm (Pacific Time) Phone: (541) 335-0338Fax: (541) 335-0305probesorder@Toll-Free Ordering for USA:Order Phone: (800) 438-2209Order Fax: (800) 438-0228Technical Service:8:00 am to 4:00 pm (Pacific Time) Phone: (541) 335-0353Toll-Free (800) 438-2209Fax: (541) 335-0238probestech@Invitrogen European Headquarters Invitrogen, Ltd.3 Fountain DriveInchinnan Business ParkPaisley PA4 9RF, UKPhone: +44 (0) 141 814 6100Fax: +44 (0) 141 814 6260Email: euroinfo@ Technical Services: eurotech@ For country-specific contact information, visit .Further information on Molecular Probes products, including product bibliographies, is available from your local distributor or directly from Molecular Probes. Customers in Europe, Africa and the Middle East should contact our office in Paisley, United Kingdom. All others should contact our Technical Service Department in Eugene, Oregon.Molecular Probes products are high-quality reagents and materials intended for research purposes only. These products must be used by, or directl y under the super v ision of, a tech n ically qualified individual experienced in handling potentially hazardous chemicals. Please read the Material Safety Data Sheet provided for each product; other regulatory considerations may apply.Limited Use Label License No. 223: Labeling and Detection TechnologyThe purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and compo-nents of the product in research conducted by the buyer (whether the buyer is an academic or for-profit entity). The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or oth-erwise use this product or its components or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for any Commercial Purpose, and that such collaborator agrees in writing (a) to not transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for Commercial Purposes. Commercial Purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to: (1) use of the product or its components in manufacturing; (2) use of the product or its components to provide a service, information, or data; (3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or (4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research. Invitrogen Corporation will not assert a claim against the buyer of infringement of the above patents based upon the manufacture, use or sale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine or prophylactic product developed in research by the buyer in which this product or its components was employed, provided that neither this product nor any of its components was usedin the manufacture of such product. If the purchaser is not willing to accept the limitations of this limited use statement, Invitrogen is willing to accept return of the product with a full refund. For information on purchasing a license to this product for purposes other than research, contact Molecular Probes, Inc., Business Development, 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, Tel: (541) 465-8300. Fax: (541) 335-0354.Several Molecular Probes products and product applications are covered by U.S. and foreign patents and patents pending. All names con-taining the designation ® are registered with the U.S. Patent and Trademark Office.Copyright 2009, Molecular Probes, Inc. All rights reserved. This information is subject to change without notice.。
活性氧ROS分析试剂盒H2DCFDA
活性氧ROS 分析试剂盒 H 2DCFDA说明书修订日期说明书修订日期：：2015.07.13Cat number ：KGAF018Store at -20℃ for 6months ，避光For Research Use Only （科研专用）一、产品描述我们提供还原型具有细胞膜透性的ROS 荧光探针衍生物。
还原型与乙酰化形式的2'，7'-二氯荧光素（DCF ）是无荧光的乙酸酯基团，在胞内可以被酯酶氧化或水解，从而脱去，生成带电荷形式的探针。
利用合适的激发光源可以很方便地在各种检测平台上观察测量，如流式细胞仪、荧光酶标仪和荧光显微镜。
由于染料很容易受到光氧化，在进行实验时必须必须全程注意避光。
相比较其非羧基衍生物，羧基-H2DCFDA 带有额外的负电荷。
羧基-H2DCFDA SE 是带有一个氨基活性的琥珀酰亚胺酯基团,可与与胞内成分以共价形式更持久的结合。
二、产品包装三、操作说明制备储液工作液必须新鲜配制，实验结束即可丢弃稀释过的多余探针，染料在水溶液中更容易氧化分解，请尽快用完。
在最低探针加载浓度的条件下，本试剂盒提供的探针，可以满足切片或悬浮细胞（设置加载孵育液体积每个反应不超过2mL 的情况下）至少1000 TESTS 。
一般注意事项一般来说，只要能获得足够的荧光信号即可，尽量选择最小浓度的AM 酯，尽量减少AM 酯的水解副产物（甲醛和乙酸）的富集。
加载条件的选择尽可能考虑原有细胞的自然生长条件。
一些研究者给出的建议是：生理温度较之室温对于染料的加载效果更好。
综合考虑，我们推荐您在进行ROS 检测时，优先使用具有细胞膜透性的ROS 探针，如羧基-DCFDA 或者荧光素二醋酸（FDA ）。
加载探针1.1 制备活细胞悬浮液（106细胞/mL ）。
注意：对象是贴壁细胞的话，条件与悬浮细胞类似。
用PBS 稀释AM 加载溶液（参见步骤2）浸没贴壁细胞（或细胞爬片）。
1.2 用PBS 或者HBSS 稀释10mM 的AM 原液，制成AM 加载工作溶液（终浓度为1~10µM ）。
细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书中文版主要用途
细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂是一种旨在通过二甲基4亚硝基苯胺，受到单线态氧气一的作用，出现去色现象，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。
其适用于各种活体细胞(动物、人体等)内单线态氧气的检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。
技术背景超氧自由基阴离子(6UPerOXideradiCaI；O2过氧化氢(hydrogenperoxide；H2O2)、羟自由基或氢氧基(hydroxylradical；0H)、过氧化基(ρeroxylradical；R00'氢过氧自由基(hydroperoxyl；HOO烷氧自由基(alcoxy!radical).氮氧基(niiricOxide；NO)、过氧亚硝基阴离子(PerOXyniIrileanion；ONOO)次氯酸(hypochlorousacid；HCl0)、半酸自由基(SemiqUinoneradiCaI)、单线态氧气(Singletoxygen)等细胞内活性氧族(ReaciiveOxygenSpecies;ROS)的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。
其中单线态氧气(SinglelOXygen；I02)是分子轨(O2)的抗磁形式或电激发形式。
通过染料分子，例如孟加拉红(RoSeBengal),亚甲基兰(MelhyIeneBIue)、吓咻类化合物(PorPhyrinS)染料的光敏过程中能量转移产生，或过氧化氢和次氯酸的化学反应产生。
单线态氧气可以调节紫外线A辐射的生物学作用、激活各种细胞信号通路等。
单线态氧气会导致植物的光动力损伤(photodynamicdamage)和动物心血管问题。
基于二甲基・4.亚硝基苯胺(NH-DimeihyLp-Iiiirosoaniline;PNDA或RNO)作为单线态氯气的选择性受体，在单线态氧气的存在下，产生去色作用，在分光光度仪下(44Onm波长)，呈现吸光峰值的降低。
细菌氧化应激活性氧(ROS)高质荧光测定试剂盒产品说明书
细菌氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细菌氧化条件下，产生荧光，来定量检测细菌活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种实验用细菌菌株氧化应激活性氧的分析。
产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。
技术背景细菌作为模式生物，是环境化学毒性研究的常用工具。
活性氧的检测可以用于诸如多环芳烃化合物或重金属的毒性作用以及修复（remediation）的评价指标。
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。
氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。
体外活性氧活性氮检测试剂盒结果示例说明
体外活性氧活性氮检测试剂盒结果示例说明体外活性氧/活性氮检测试剂盒是一种用于测量总自由基含量的检测试剂盒一个样本。
该分析使用专有的淬灭荧光探针，二氯二氢荧光素DiOxyQ（DCFH-DiOxyQ），是一种特定的ROS/RNS探针，基于与流行的2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯。
DCFH DiOxyQ探头首先用然后以高反应性DCFH形式稳定反应状态下，ROS和RNS物质可以与DCFH反应，DCFH被迅速氧化成荧光2'，7'-二氯二氢荧光素（DCF）（图1）。
荧光强度成比例与样品内的总ROS/RNS水平相关。
DCFH DiOxyQ探针可与氢气反应过氧化物（H2O2）、过氧自由基（ROO）、一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸根阴离子（ONO-). 这些自由基分子是ROS和RNS的代表，因此允许测量样本中的总自由基群体。
OxiSelect™ 体外ROS/RNS测定试剂盒也可以用于评估抗氧化剂对自由基的影响。
该试剂盒的检测灵敏度极限为10pMDCF和H2O2分别为40nM。
每个试剂盒提供足够的试剂，最多可进行96次分析，包括标准曲线和未知样品。
体外活性氧/活性氮检测试剂盒相关研究：1.STA-330：OxiSelect™ TBARS测定试剂盒（MDA定量）2.STA-340：OxiSelect™超氧化物歧化酶活性测定3.STA-341：OxiSelect™过氧化氢酶活性测定试剂盒4.STA-342：OxiSelect™细胞内ROS测定试剂盒（绿色荧光）体外活性氧/活性氮检测试剂盒结果示例：上图2显示了典型的自由基ROS/RNS测定结果。
荧光在SpectraMax Gemini XS荧光计（Molecular Devices）上进行测量，该荧光计具有485/538nm滤光片组和530nm截止波长。
以下数据仅供参考。
此数据不应用于解释实际结果体外活性氧/活性氮检测试剂盒相关文献：1. Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, Thomas M. Flow cytometric studies ofoxidative product formation by neutrophils: A gradedresponse to membrane stimulation. JImmunol. 1983; 130:1910-1917.2. Brandt R, Keston AS. Synthesis of diacetyldichlorofluorescin: A stable reagent for fluorometric analysis. Anal Biochem. 1965; 11:6-9.3. Keston AS, Brandt R. The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide.Anal Biochem.1965; 11:1-5.。
体外活性氧活性氮检测试剂盒说明书
体外活性氧活性氮检测试剂盒说明书活性氧（ROS）和活性氮（RNS）是公认的分子导致氧化应激的有害影响。
与氧化应激的增加与几种疾病状态的发病机制有关。
这个氧化应激在血管疾病、糖尿病、肾缺血、动脉粥样硬化、肺疾病中的作用病理状态、炎症性疾病、癌症以及衰老都已得到充分证实。
自由的自由基和其他活性物质在体内不断产生，对人体造成氧化损伤生物分子，这一过程受到多种抗氧化剂和修复系统的制约，如以及替换受损的核酸、蛋白质和脂质。
衡量抗氧化疗法和ROS/RNS活性对抑制或治疗氧化应激至关重要诱导剂。
体外活性氧/活性氮检测试剂盒提供了一种灵敏的方法，可以检测多种样品类型中的总活性氧（ROS）和活性氮（RNS）。
该测定采用专有的荧光探针DCFH-DiOxyQ；探针用去猝灭剂灌注成高反应性DCFH形式。
在ROS和RNS的存在下，DCFH被快速氧化为高荧光DCF。
体外活性氧/活性氮检测试剂盒基本参数：中文名称：OxiSelect 体外ROS/RNS检测试剂盒（绿色荧光）英文名字：OxiSelect In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Green Fluorescence)建议保存条件：4ºC体外活性氧/活性氮检测试剂盒组分：1.底漆试剂（234701）：一管250µL溶液。
2.稳定溶液（10X）（234702）：一管1.5 mL溶液。
3.催化剂（250X）（234703）：一管20µL溶液。
4.DCF DiOxyQ（234704）：一个50µL琥珀色甲醇溶液管。
5.DCF标准品（234202）：一个100µL琥珀色管，含有1mM DMSO溶液。
6.过氧化氢（234102）：一个100µL琥珀色管，装有8.821M溶液。
活性氧的检测方法
用电子自
旋共振检测结果规律相似。这两者各有优 点, 电子自旋共振法虽操作相对简便, 但所 用仪器昂贵, 而羟胺氧化法所需费用则要低 得多。运用羟胺氧化法时还必须严格控制 反应系统 pH< 8. 0, 并尽可能降低反应中的 溶解氧及铁含量 , 这样测出的 O 2. 产生速率 才更接近实际水平。 2 OH 的检测 由于 OH 是生 物 体 内最 活 泼 的活 性 氧, 寿命极短, 故给检测带来了困难。过去 人们主要是根据 SOD 和 CAT 对其产生的 抑制作用以及 OH 清除剂 ( 如乙醇 、 甘露 醇、 叔丁醇、 苯甲酸钠、 生育酚等) 对其产 生的 清除作用 等来估测 OH 水平。此 外, 还可用 DMPO ( 5, 5 二 甲基 1 吡咯 啉 N 氧化物 ) 作为自旋捕获剂进行电子顺 磁共振 ( EPR ) 自旋捕获以及检测蛋氨酸 形成乙烯的速率等估测 OH 的产生[
摘要 关键词
简述近代植物组织活性氧的检测方法及其例证。 活性氧 自由基 检测
凡是含有不成对电子的分子、 原子或离 子都统称为自由基。所有的自由基都有极 高的化学活性 , 非常活泼, 具有很强的氧化 能力, 常常与相邻的物质迅速反应, 寿命极 短且浓度低, 可以发生链式反应。生物自由 基是通过生物体自身代谢产生的一类自由 基, 具备一般自由基所具有的上述特点。 生物 体内的 自由基 主要是 指活性 氧。 所谓活性氧就是氧的某些中间代谢产物或 含氧的衍生 物质, 具有比氧 更强的氧 化能 力。在植物组织中, 活性氧类型主要有: 超 氧阴离子( O2. )、 过氧化氢 ( H 2 O2 ) 、 羟自由基 ( OH ) 、 单线 态氧 ( 1 O2 ) 和脂质过 氧化自由 基( ROO ) 等。它们存在于植物细胞壁、 叶 绿体、 线粒体、 微粒体和细胞核等部位。在 正常情况下 , 活性 氧水平很 低不会引 起伤 害, 细胞内活性氧的产生与清除处于一种动 态平衡状态。一旦这种平衡被打破 , 就可能 产生伤害作用 , 首当其冲的就是膜系统, 导 致膜脂过氧化或脱脂化, 膜差别透性丧失, 离子大量外渗 , 引起一系列生理生化变化, 代谢紊乱 , 严重时植物死亡。 50 年代初期出现了自由基生物学 , 但由 于当时借助的是电子共振仪来研究自由基 , 其仪器昂贵 , 难于普及, 阻碍了这一学科的发
活性氧检测
活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。
Ro sup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。
一、注意事项1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
二、使用说明1、装载探针对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。
对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。
按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。
去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。
加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。
37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。
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PH0630|活性氧检测试剂盒
Reactive Oxygen Species Assay Kit
Catalog No：PH0603Size：☐100~500Tests Store at-20℃
活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种基于荧光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。
进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不会通透细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。
细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。
在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。
Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。
根据检测体系和检测方法的不同，本试剂盒可测定100~500次。
试剂存储
冰袋运输。
-20℃干燥避光保存，有效期一年。
试剂组分
编号组分规格保存方法
PH0630-A DCFH-DA（10mM）0.1mL-20℃，避光保存
PH0630-B活性氧阳性对照（Rosup,100mM） 1.0mL-20℃，避光保存
使用说明
检测步骤
1.装载探针
1.1原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）
①细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
【注】：必须保证细胞状态健康，且检测时不会过度生长。
②药物诱导：去除细胞培养液，加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。
（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30min-4h 可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。
【如，HeLa细胞孵育30min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h；】
③探针准备：探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM。
④探针装载：吸除诱导用药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。
加入的体积以能充分盖住细胞为宜。
如，对于6孔板通常不少于1000μl，对于96孔板通常不少于100μl。
37℃细胞培养箱内避光孵育30min。
⑤细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
1.2收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞。
①细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态健康。
按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
②药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。
（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30min-4h 可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。
【如，HeLa细胞孵育30min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h；】
③探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM。
④探针装载：去除细胞内药物，离心收集细胞，加入适当稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。
【注】：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。
如，对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。
每隔3-5min 颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
⑤细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2、检测
原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
DCF
的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
DCF的激发光谱和发射
光谱参考下图。
其他事项说明：
1）对于刺激时间较短（通常2h以内）的细胞，也可先装载探针，后用活性氧阳性对照和/或感兴趣药物刺激细胞，如阳性对照刺激，应先加入适量探针于37℃避光孵育30min；然后再加入等体积2×阳性对照Rosup溶液（200μM），37℃避光诱导30min-4h；
2）阳性对照Rosup通常浓度为100μM。
通常刺激后30min-4h可以观察到显著的活性氧水平升高。
对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。
如果在刺激后30min内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。
如果活性氧升高得过快，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
3）对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1∶2000～1∶5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA 的浓度为2～5μM。
探针装载的时间也可以根据情况在15～60min内适当进行调整。
4）活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
注意事项
1）探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2）探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3）尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。