蛋白表达纯化实验步骤教学内容
蛋白表达纯化流程
蛋白表达纯化流程第一章蛋白表达纯化一、诱导表达分析1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化2.1重组蛋白的提取2.1.1 提取缓冲液20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。
如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。
还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。
7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。
蛋白表达纯化实验步骤之欧阳术创编
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h 左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD=1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白表达纯化的实验原理
蛋白表达纯化的实验原理蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术，可以用来研究和生产各种蛋白质。
本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。
第一步：蛋白表达系统的选择蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。
选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。
第二步：构建表达载体表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中，以实现蛋白表达的工具。
通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割，然后与适当的载体连接。
第三步：细胞转染或感染将构建好的表达载体转染到细胞中，使目标蛋白基因在细胞内进行表达。
对于真核细胞（如哺乳动物细胞）可以通过转染的方式传递质粒DNA，而对于原核细胞（如大肠杆菌）可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。
第四步：培养表达细胞转染或感染后，需要将细胞培养到合适的条件下，以促进目标蛋白表达。
培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。
此外，可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂，以调控蛋白表达的级别。
对于细菌目标蛋白表达，通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。
第五步：蛋白表达检测为了确定目标蛋白是否在细胞中表达，可以使用多种方法进行检测。
常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。
同时，可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。
第六步：蛋白纯化蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。
纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。
常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。
此外，还可以使用亲和标签（如His标签、GST标签等）来辅助蛋白质的纯化。
第七步：蛋白质的鉴定和定量通过蛋白纯化后，需要对目标蛋白进行鉴定和定量。
可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。
蛋白质的表达纯化
400ul
750ul
1800ul
50ul
10ul
灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。
01
加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。
1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）
5ml
3ml
4ml
120ul
20ul
30%Arc-Bis
Tris-HCl pH 6.7
H2O
10%AP
6
稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。
7
注意事项
将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。 在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。
氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化
重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 ℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。
氨苄青霉素：100mg/mL
Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3
蛋白表达纯化实验步骤教学内容
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
蛋白纯化protocol备课讲稿
蛋白纯化p r o t o c o l诱导表达1、挑取含重组质粒的单菌落至５ml LB（含抗性）培养基中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０µl菌接种到含５ml LB （含抗性）培养基的5 ml试管中, 37 ℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8（最好0.6，单抗大约需２－２.5 hr，双抗大约需３－３.５hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在合适温度下震荡培养４hr。
4、分别取菌体0.5 ml, 离心10000 g × 1 min收获沉淀，用４０µl蛋白loading buffer重悬，混匀，煮沸５min。
5、离心10000 g × 5 min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
蛋白质纯化亲和层析一、样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-20 ℃或立即进行步骤2操作。
2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。
再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。
3) 10000 g，4 ℃离心20－30 min。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
二、层析1) 将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化4) 分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因 c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
动等原因，要及时调整。
溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。
注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。
8、取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。
10000rpm，15min，4°离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。
（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。
平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。
）9、纯化上清---摸洗脱条件。
1）镍柱处理。
将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。
（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml 的枪将胶体吹散。
《蛋白表达纯化》课件
基础研究领域
用于解析蛋白质结构与功能、 探究生物过程和疾病机制等。
02
蛋白表达系统
原核表达系统
操作简便
原核表达系统通常在相对较低的 成本和较短的时间内实现蛋白表 达。
高表达量
原核细胞具有较高的繁殖速度， 因此可以快速获得大量的目标蛋 白。
原核表达系统
• 蛋白翻译后修饰少：原核细胞没有真核细胞复杂的翻译后 修饰机制，因此表达的蛋白通常不需要复杂的纯化步骤。
案例三：融合蛋白的表达与纯化
总结词
融合蛋白表达纯化的优势和应用
详细描述
融合蛋白是指将两个或多个蛋白质序列融合在一起形成的单一蛋白质。这种技术常用于 蛋白质标签、蛋白质相互作用研究、抗体药物等领域。融合蛋白的表达纯化具有一定的 复杂性，但通过选择合适的融合伙伴和优化表达纯化条件，可以获得高纯度和稳定性的
实验试剂的储存与使用
实验试剂应按照规定的要求进行储存， 避免因储存不当导致试剂变质或失效。
使用前应仔细核对试剂的名称、浓度、 使用过程中应控制试剂的用量，避免浪
有效期等信息，确保使用正确的试剂。
费和环境污染。
06
案例分析
案例一：重组蛋白的表达与纯化
总结词
重组蛋白表达纯化的基本流程和技术要点
详细描述
重组蛋白表达纯化是生物技术领域中常见的技术手段，主要涉及基因克隆、载体构建、转化、诱导表 达、纯化等步骤。其中，选择合适的载体和宿主细胞、优化表达条件以及纯化方案的制定是关键。
案例二：膜蛋白的表达与纯化
总结词
膜蛋白表达纯化的特殊技术和挑战
详细描述
膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入细胞膜中，具有跨膜结构域。膜蛋白的表达和纯化相对于可溶性蛋白具有 一定的难度。常用的表达系统包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。纯化时需考虑保持膜蛋白的天然状态和功能。
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验步骤一：材料准备1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒二：实验操作1.试剂准备：2.2. 获得目的基因①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
3. 构建重组表达载体①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
4. 获得含重组表达质粒的表达菌种①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。
②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。
重组蛋白的表达与分离纯化
基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经SDS-PAGE检测。
实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。
蛋白的表达纯化
蛋白的表达纯化一、溶液配制1×SDS凝胶上样缓冲溶液配方：Tris-HCl pH6.8 50mmol/L巯基乙醇 5%SDS 2%溴酚蓝 0.1%甘油 10%蛋白纯化配制以下溶液，用于重组蛋白的镍螯合层析分离：低浓度咪唑缓冲液（Low imidazole buffer, L-buffer）Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.4 20mMNaCl 0.5mol/LImidazole 25mM高浓度咪唑缓冲液（High imidazole buffer, H-buffer）Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.4 20mMNaCl 0.5mol/LImidazole 500mM二、天然条件下小量纯化目的蛋白步骤：1)当诱导表达的菌体浓度达到一定程度时，测定培养物的OD600值，4℃，12000rpm离心5min，收集菌体。
2)用L-Buffer洗涤菌体一次，然后重悬至OD600=20，冰浴条件下超声破碎菌体细胞10min（功率320W）。
然后4℃，12000rpm离心30min。
3)取1ml上清转入1.5ml的干净离心管中，加入50ulNi-NTA Agrose，4℃轻柔混匀结合60min。
4)12000rpm离心10S，小心吸去上清。
5)用100ul的L-Buffer漂洗树脂，操作时要轻柔混匀。
12000rpm离心10S，小心吸去上清，漂洗两次。
6)用20ul的H-Buffer洗脱目的蛋白，操作时要轻柔混匀，12000rpm离心10S小心将上清转入干净小管中，洗脱四次。
7)SDS-PAGE分析各管组分。
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程2010年02月27日星期六09:02丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图11:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA 出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图21:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
蛋白表达纯化步骤
一证明目的蛋白有表达1 挑取一单菌落接种于含（AMP，终浓度为100g/ml）的3ml液体LB培养基中37℃，250rpm 培养过夜。
2 将过夜培养菌液以1:100转接于含抗生素的100ml液体LB中，37℃，250rpm 3.5h（大量培养至OD600=0.6左右）3 取出1ml菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养物加入IPTG至终浓度为1mmol/L。
继续震荡培养4h。
4 以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液做对比，SDS-PAGE检测。
结果如图一1未诱导2未诱导3诱导后4诱导后二表达的情况，是可溶还是沉淀1 将上述的37℃诱导的菌液离心（4℃，12000,5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl溶液洗菌。
2 重悬于0.9% NaCl溶液的菌体离心，（4℃，12000,5min），弃上清（0.9% NaCl溶液），得菌体，称菌体重量，悬于8ml PBS（PH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/ml的菌液终浓度。
3 超声波破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声波设置如下：功率：400W 工作：15min 间隔：45s 全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加DNA酶会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没有加DNA酶），不然分不开）4 将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000,5min），分别收集上清和沉淀，各取1ml，加入1ml 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如图2三探索可溶表达条件有上述结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性表达，但是量很少，大部分以包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明蛋白的表达量很高，上清可溶性蛋白的可操作性等因素的干扰优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶性蛋白的表达条件，最终加大上清可溶性蛋白的含量，以便实现下一步实验的进行。
蛋白表达纯化学习教案
应用： 纯化抗血清或腹水中的总IgG,对人 IgG3, 小鼠 IgG1, 大鼠 IgG2a等具有高亲和力 第15页/共18页
第十六页，编辑于星期三：点 四十分。
蛋白纯化常见问题
没有出现纯化蛋白
－－纯化前将目的蛋白的表达量进行优化，确保表达量最大 －－保证蛋白在纯化过程中不降解，纯化条件低温、纯化速度快
第2页/共18页
第三页，编辑于星期三：点 四十分。
原核表达
I 重组表达载体克隆
目的基因的获取
选择载体、构建重组表达质粒
转化受体菌
重组体的筛选鉴定
1. 目的基因获取： 基因组DNA、mRNA反转录cDNA、人工合成
2. 常用载体 ： His标签： pET系列（pET28a、pET32a）、pQE系列
样品处理：
• 收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。离心，取上清。
缓冲液配制：
成分
Tris-HCl（PH 7.9）
咪唑
NaCl
Soluble Binding Buffer
20 mM
10 mM
0.5 M
请使用高纯度的S试o剂lu配b制l缓e 冲E液lu，ti并o通n过B0u.4f5feµrm过滤器过滤。为避免柱2子0 被m堵M塞，建议将裂解液50进0行m离M心，或者使用0.04.55µMm过滤器过滤。
GST标签：pGEX系列 3. 构建重组质粒：
选择合适的内切酶位点、酶切、连接
4. 转化感受态细胞： 热击法转化非表达型感受态菌
5. 重组体的鉴定：
阳性抗药克隆菌落PCR
阳性抗药克隆提粒、酶切鉴定
测序
第3页/共18页
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
真核蛋白表达及纯化步骤
真核蛋白表达及纯化步骤
真核蛋白表达及纯化步骤如下：
1. 重组质粒构建：
a. 目的基因的获取：基因合成、PCR。
b. 线性载体的获取：载体酶切，获取线性载体。
c. 重组反应：根据连接酶说明，进行线性载体和目的基因片段的酶连；转化涂板（相应抗性）。
d. 质粒验证：质粒验证图，质粒测序验证。
2. 蛋白诱导表达：普适条件查看蛋白是否表达（如本实验室在BL21（DE3）中，37℃，1mM IPTG诱导表达5h）。
若不表达，更换载体、表达菌株等方法查看是否表达；若表达，继续进行下面实验。
3. 蛋白表达部位分析：分析蛋白是可溶性的还是不溶性的表达，即在超声后上清表达还是沉淀表达；是否与你的目标蛋白表达部位相同，相同进行后续蛋白表达条件优化。
4. 蛋白小量表达条件优化：优化诱导IPTG浓度、诱导温度。
5. 蛋白大量表达：根据小量表达优化的条件等比例放大培养。
6. 蛋白纯化：根据目标蛋白的性质（可溶性蛋白or膜蛋白）进行样本处理。
然后进行亲和纯化，获取目的蛋白。
蛋白表达纯化实验步骤之欧阳道创编
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm 摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
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蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。
另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。
3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140rpm左右。
4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。
加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。
每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。
可用4支50ml的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。
10、超声波裂解。
1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。
注意:1.要冰浴。
2.要随时观察裂解情况以防意外。
3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。
一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。
4.正常声音为:孜孜声,尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因,要及时调整。
溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成(后面3000转离心时,如果沉淀少说明裂解的好)。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关)。
注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF),PMSF工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解60分钟,60分钟足够裂解。
11、取得上清1)将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。
10000rpm,15min,4°离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。
(此时可以测量一下pH值,pH值最好在7.5左右。
平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在7.5左右。
)12、纯化上清---摸洗脱条件。
1)镍柱处理。
将1ml镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2)将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。
(若是流速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。
)取20μl过柱后的样品,以备跑胶。
3)分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。
每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。
每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中,以备跑胶。
注意:理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度,直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。
实际上测不到零,怎么都会有一点的,上面说的量已经做够洗脱了。
4)加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。
上样量为4.5ml(将前面的0.5ml单独接入EP管,再将后面的4ml接入另外两个EP管),留跑胶样品。
5)加MES将NI柱重生。
MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O。
流完后保存于2倍体积的20%乙醇中,镍柱至少能重复利用6次。
(尿素可能对NI柱有损伤。
)注意:所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大。
镍柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。
13、跑胶验证。
1)跑2块0.75mm的PAGE胶,把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。
2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3)300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。
(也可以300V,30min,只是图没有160V好看。
)4)考马斯亮蓝染色。
一般染色2h即可。
5)脱色。
先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。
14、纯化上清---收集目的蛋白1)将重生的镍柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3ml)。
2)重复步骤12中的操作,只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。
15、跑胶验证。
同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点(用160V),保存好。
16、透析。
1)配制2L透析液(配方见附件1),并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。
2)透析袋(剪10cm即可)用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗净。
3)用透析夹将透析袋夹住(将透析袋折叠一下会夹的更牢),将洗脱的蛋白样品加入其中,置入提前预冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl)中。
冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。
透析3次即可。
注意:用广口瓶装透析液,将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。
冰浴以防活性降低。
17、浓缩。
1)将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中,用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。
2)30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。
3)每隔10min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩。
4)透析袋用完后,洗净,保存于20%乙醇中4°存放。
注意:浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现,由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高,不易发现小颗粒或絮状沉淀,要看仔细。
如果看不到,可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。
用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分装后-20度保存。
18、超滤法浓缩、透析蛋白。
使用超滤法就可省去16、17两步。
1)将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。
2)配平。
3)7400g,30min,4°离心,结束时4ml变为1ml左右。
浓缩4倍。
可根据需要选择不同的离心时间,以达到不同的浓缩倍数。
可以几次的Elution液一起浓缩。
4)加入需要的蛋白储存液至4ml,离心。
重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。
蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。
如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油(1%-5%即可)助溶。
5)收集。
将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分,蛋白名称,蛋白浓度(测量后),制备日期。
注:超滤管的使用方法见附件419、蛋白浓度测定。
见附件320、蛋白活性测试。
转染细胞测量荧光。
21、抗原处理。
蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。
22、注射兔子。
选择合适的注射方式和合适的免疫程序。
23、收集免疫血清。
提取抗体。
24、抗体效价评定。
附件1所需溶液配方:1)20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量(g)1L 0.5928 5.802192 17.5322)Equilibration Buffer(平衡缓冲液): PBS with 10 mM 咪唑pH 7.43)Wash Buffer(清洗缓冲液): PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH 7.44)Elution Buffer(洗脱缓冲液): PBS with 250 mM 咪唑pH 7.45)MES(再生缓冲液): 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodium chloride; pH 5.0。
即0.3904g MES+0.5844g NaCl.6)透析袋处理液: 2%(w/v)碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA7)透析液:20mM PBS+50 mM NaCl(2.92g)试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量(g)1L 0.5928 5.802192 2.92gTIPS:1—4的溶液可以一起配制。
先配10ml 8M的咪唑。
再配1L的PBS,用500ml水将试剂溶解,取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中,作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer,再向其分别加入适当体积的8M咪唑。
最后,定容。
Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml,Equilibration Buffer配了300ml。
PBS配了500ml。
附件2包涵体检测1.摇10ml菌,加0.5%葡萄糖和相应抗性。
培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温(16-25度)诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。
在离心前取500μl菌液作为负对照,诱导完成后取500微升作为正对照。