药敏试验方法简介

三、药敏试验方法学
1.手工试验
• 纸片扩散法（K-B法） • 稀释法（MIC法）
– 肉汤稀Fra Baidu bibliotek法
• 常量稀释法 • 微量稀释法
– 琼脂稀释法 • E-test法
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2.自动仪器药敏系统
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纸片扩散法（K-B法）
原理：抑菌圈的大小反映受试菌对测定药 物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈 负相关。
4. 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化 的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面；
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5. 35℃孵育16～24小时，量 取抑菌圈直径；
6. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
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CLSI对K-B法的标准化规定
纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、 平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、 质控方法等；常规测试、报告的抗生素。
Increasing Antibiotic Conc.
MIC = 8
.25
0.5
1
2
4
8
16
32
MIC (最小抑菌浓度) = 抗生素可抑制细菌生长 的最小浓度。
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常量稀释法
药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤 管中. 过夜培养. MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一 管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡 到50℃的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为 104CFU/ml). 解释标准(S or R) 是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上
钙镁离子含量、锌离子含量 （用27853氨基糖苷类和亚胺
– 苛养菌放普通环境生长 不良，导致假敏感
配能结果监控）
• 培养时间
菌悬液
– 粘液性铜绿需48小时
浓度高抑菌环缩小（假耐药）• 测量方法
浓度低则扩大（假敏感） .
稀释法
以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培养 基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀 释），培养16～24h后，通过观察细菌生长 现象来测得药物对受试菌的最低抑菌浓度 （MIC）。
理用药，避免产生或加重细菌的耐药； 监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌
握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防 耐药菌感染的发生和流行。
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（1）抗菌药物的选择 在我国主要遵循临床实验室标准化委员会
（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌药物选择原则 Ø A组：对特定菌群常规测试并报告的药物 Ø B组：可常规测试、选择性报告的药物 Ø C组：替代性或补充性药物 Ø U组：仅用于泌尿道感染的抗菌药物
钙镁离子含量（钙10-25； ，由于碳酸的影响，药
镁10-12.5μg/ml）
物活性受到影响，形成
菌悬液（5×104CFU/ml）
假敏感或假耐药
接种效应
• 培养时间
浓度高MIC抬高
– 真菌需48小时
浓度低MIC压低
– 奴卡菌需5天
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E-test法
将稀释法和扩散法的原理结合起来，直接 测定药物对受试菌的MIC 。
不同的药判定标准不同；不同的菌判定标 准也不同。
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扩散法药敏影响因素
培养基
• 细菌纯度
pH值7.2-7.4
• 气体环境
营养程度（肠球菌能生长）
– 普通细菌放CO2时由于
厚度
碳酸的影响，药物活性
抗生素拮抗剂含量（用29212 监控）
受到影响，形成假敏感 或假耐药
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药敏结果报告可用MIC（μg/ml）或对照 CLSI标准用S、R和I报告。
对于稀释法的批量试验，有时需要报告 MIC50、MIC90。
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稀释法药敏影响因素
培养基
• 细菌纯度
pH值 7.2-7.4
• 气体环境
营养程度
– 所有需氧细菌均放普通
抗生素拮抗剂含量
大气环境。如果放CO2
104 cfu/ml
mg/ml 4 2 1 0.5 0.25 0.12 0
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微量肉汤稀释法
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接种后应充分混匀，但不能有气泡产生 静置培养 培养温度；35℃ 气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大 气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微 需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2 培养时间：18小时
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敏感：分离菌株能被测试药物使用推荐剂 量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓 度所抑制
耐药：分离菌株不能被测试药物常规剂量 可达到的药物浓度所抑制；分离菌株可能 存在某些特定的耐药机制；治疗研究显示 药物对分离菌株的临床疗效不可靠
耐药＝治疗无效；敏感≠治疗有效
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二、抗菌药物的种类及作用机制
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葡萄球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组
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肠杆菌科抗菌药物敏感试验推荐分组
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假单胞菌属的抗菌药物药物敏感推荐分组
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不动杆菌属的抗菌药物药敏试验推荐分组
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肠球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组
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肺炎链球菌抗菌药物药敏试验推荐分组
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药敏试验的折点亦遵照每年最新公布的 CLSI标准进行，分为敏感（S）、耐药（R） 和中介（I）。
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稀释法（MIC法）
MIC法：分为常量法和微量法
Ø 常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法
Ø 微量法：微量肉汤稀释法
p 简化双浓度折点法 ATB药敏
p 简化常规浓度分布MIC法 BD、德 灵药敏
p 动力学计算MIC法 VITEK2药敏
VITEK32、
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肉汤稀释法
不生长 = 抗生素抑制细菌生长 生长 = 抗生素无法抑制细菌生长
药敏试验方法简介
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耐药菌问题日益严重
“目前药物失去作用的速度与科学家发 现新药物的速度差不多。”
摘自WHO报告
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抗微生物治疗面临的困境
•抗药性问题始终存在 •细菌不断获得新的耐药机制 •以往对付耐药性的策略收效不显
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一、 抗菌药物敏感试验（AST）
预测抗菌治疗的效果； 指导抗菌药物的临床应用； 发现或提示细菌耐药机制的存在，指导合
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MIC与抑菌圈直径的线性关系
Log2. MIC
R
I
S
耐药
中介 敏感
d1 d2 抑菌圈直径（mm)
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1. 准备抗菌药物纸片和水解酪蛋白（M-H）培养基； 2. 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水
管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准；
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3. 用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余 菌液，然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次 旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周；