第三章 藻类基因工程

现已证明，来自大肠杆菌、枯草杆菌以及人的 一些外源基因可以在蓝藻中表达，例如大肠杆菌 谷氨酸脱氢酶基因在蓝藻中表达引起抗铵，人的 超氧化物歧化酸(superoxide dismutase， SOD)基因 在蓝藻中表达以减少氧胁迫。这就可能通过引入 外源基因，以赋于蓝藻新的遗传特性，或作为重 要的天然产物基因表达的宿主。目前还成功地将 芽孢杆菌的杀虫毒素基因导入并表达于几种蓝藻 细胞中。这些都标志着蓝藻基因工程正向着实用 目标迈进。
穿梭载体能否在宿主蓝藻中稳定维持取决于多方面 的原因:首先，蓝藻中存在多种限制性内切酶，实际上， 已在E.coli中实现商品化生产的多种限制性内切酶如 Ava I、AvaⅡ等都来源于蓝藻，解决的办法是利用携 有合适的甲基化酶基因的E.coli宿主，对穿梭载体的 特异位点进行甲基化修饰，从而改善其在蓝藻中的稳 定性。其次，导入的质粒与宿主质粒之间可能发生同 源重组，因此，转化前对内源性质粒的清除显得非常 必要。Matsunaga等(1990)对海洋蓝藻Synechococcus NKBG 042902-YG1116的转化试验中，用溴化乙锭处理 藻株，清除内源质粒pSY10与pSY09，得到很好的效果， 而未经处理的藻株，则不能被转化。
脉冲匀直变角电泳(PHOGE)技术的应用带来基 因定位工作的突破。Bancroft等1989年借助于限 制酶切、PHOGE与Southern杂交技术，已得到 Anabaena PCC 7120的基因图谱，结果表明，尽 管蓝藻基因的组织也采用操纵子的形式，但功能 相关的基因并非集中在一处，而是分散于染色体 上 不 同 位 置 。 继 A.PCC 7120 之 后 ， 海 洋 蓝 藻 Synechococcus PCC 7002的染色体物理图谱也 已完成。深入开展的基因克隆与基因图谱绘制工 作无疑为蓝藻的基因操作奠定了基础。
四、基因枪法
基因枪法又称微粒子轰击法，基本原理：利 用基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体作 驱动力，将吸附或包裹有DNA的金粉或钨粉微 粒高速发射，击中并高速穿透真空室中受体的 细胞壁及原生质膜到达细胞内，从而达到将吸 附于微弹上的外源DNA导入受体细胞或原生质 体，并获得整合和表达基因。
五、载体
自1973年发现蓝藻质粒以来，已在约50 %被检 单细胞及丝状蓝藻中证明了内源性质粒的存在， 质粒数目从1~10个不等，大小在1.3-130 Kb之间， 但只在极少数淡水蓝藻中找到质粒编码功能的证 据，一般认为蓝藻质粒属隐秘型质粒。至今蓝藻 质粒尚未发现可识别的遗传标记，不能在E.coli中 复制，不能作为克隆载体。
常用遗传转化方法
一、接合转移
接合转移是指利用广谱宿主接合质粒，使DNA 通过细胞接触从一种细菌转移到蓝藻。这个系统 需先构建含有目的基因、大肠杆菌、蓝藻质粒复 制起点及转移起点、选择标记的杂交质粒，转化 含有辅助质粒的E.coli菌株，再通过接合引入一个 具有编码接合装置的基因，使3种质粒由于无法复 制或整合而逐渐丢失；杂交质粒或以自主复制形 式存在，或与蓝藻染色体发生同源重组而稳定存 在。
2.重组DNA分子的构建 一般将带有目的 基因的DNA片段连接到能够独立复制并具 有选择标记的载体上，如质粒、噬菌体和 病毒等，以形成重组DNA分子。DNA片断 与载体的连接方式主要有同聚末端连接、 粘性末端连接、平齐末端连接及人工接头 分子连接。
3.重组DNA分子的转化及扩增 重组DNA 必须进入宿主细胞DNA中，才能得到扩增 和表达。根据载体的性质不同，可采用转 染、转化、转导等方式，将重组DNA分子 导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。
研 究 概 况
藻类基因工程起步较晚，60年代首先对蓝细菌 (Cyanobacteria)进行了分子遗传学的研究，近 10年来，在蓝藻载体构建、基因克隆、基因转 移、基因表达、功能分析等方面都取得了显著 的进展。这为在分子水平上了解蓝藻的合光作 用、生物固氮、细胞代谢等重要过程提供了可 能性，同时又为蓝藻的遗传操作开辟了新的前 景。
大型藻类基因工程的研究方兴未艾，特别 是质体基因组结构、序列及定位方面做了 大量的研究，并能以其基因序列进行藻类 发生和分类方面的研究，同时，对其转化 模式的建立也进行了有益的探索。高等植 物基因工程研究中发展起来的一系列直接 导入外源基因的方法可能成为藻类转基因 的有效手段，并对藻类基因工程的发展起 到促进作用。
除了依靠穿梭载体，人们还试图寻求其他 的方法。海洋蓝藻噬菌体早在1989年Bergh 就已报道，最近，又分离到一种新的海洋 蓝藻噬菌体(ms-1)并对其宿主范围进行了感 染试验，发现Synechococcus NKBG 042902 对它十分敏感。研究海洋蓝藻的噬菌体转 导机制，发展噬菌体载体系统，以期在特 异性宿主蓝藻中获得外源基因表达，为构 建蓝藻基因工程载体提供了新的思路。
第二节 用于基因工程研究的藻类
原核微藻：蓝藻
微 藻
真核微藻：绿藻、硅藻 褐藻门
大型藻
红藻门 绿藻门
1. 蓝藻门
蓝藻又称蓝细菌，是藻类中最原始的类群，是 光合自养的原核生物。蓝藻有单细胞、丝状、中 空球状和立方体等形状，但大多数蓝藻为不定型 群体，并常具有一定形态和颜色的胶被。 蓝藻分子遗传学研究始于20世纪60年代，由于 蓝藻的结构和遗传复杂性类似于革兰氏阴性细菌， 部分种类还具有天然转化系统和有效重组系统， 使得蓝藻分子遗传学得到迅速发展，在光合作用、 生物固氨、植物进化等基础研究中的地位不断上 升，目前已成为藻类分子遗传学的前沿。其自身 的理论体系和研究手段正趋于成熟。
1.2 海洋蓝藻基因转移系统
1968 年 Bazin 证 实 了 蓝 藻 的 遗 传 重 组 现 象 ， 1970 年 Shestakov与Khyen首次发现Synechococcus PCC 7943 的DNA天然转化作用。目前已确认可天然转化的蓝藻是不 产生异形胞的单细胞种类，绝大多数属于Synechococcus 与Synechocystis两个属，至今已发展了两种类型的基因 转移系统，一种是遗传转化，包括天然转化、诱导转化和 电击穿孔;另一种是接合转移。以往由于淡水蓝藻在养殖 中所处的特殊位置，遗传转化的研究得以普遍地开展。近 年来，随着海洋生物技术的发展，已分离到多种具有经济 开发潜力的海洋蓝藻，其中有些种类能够高效地进行光合 作用，有些种类则能产生一些重要的生化物质，如植物生 长调节剂、UV吸收蛋白复合体、高活性SOD与酪氨酸酶 抑制剂等等。上述特点吸引了人们将越来越多的注意力投 入到海洋蓝藻基因工程的研究，并已取得一系列成果。
至今，应用于蓝藻遗传转化的供体DNA大体可分 为三类:第一类是直接利用未修饰的外源质粒，如 pBR322，pBR328等，可将外源DNA导入蓝藻， 但效率很低，且对受体需做特殊的处理;第二类是 利用自身染色体或基因组，通过同源重组作为插 入突变的有效方法，在这方面，海洋蓝藻 Synechococcus PCC 700 Stevens，1980年有过 成功尝试，嵌入Strr标记的染色体片段天然转化成 功;第三类即是穿梭载体。研究结果表明，穿梭载 体是一方便、有效的运载体，海洋蓝藻的遗传转 化也大多采用穿梭载体作为中介（表1）。
第三章 藻类基因工程
第一节 概念及研究内容及概况
藻类基因工程亦称藻类遗传工程或藻类重组 DNA技术，是以海藻为研究对象将某种生物基 因通过基因载体或其他手段运送到海藻活细胞 中，并使之增殖(克隆)和行使正常功能(表达)， 从而创造出藻类新品种的遗传学技术。
通过对藻类基因工程的研究，一方面期望 从改造的藻体中筛选出抗性强且生长快的 优良藻种，并把藻类作为新型的生物反应 器生产某种特殊的有用物质;另一方面期望 从藻类中分离、克隆有重要经济价值的基 因，作为农作物改良的目的基因或用于微 生物发酵生产。
4.对重组克隆(recombinant clone)进行筛选 在转化实验中，一些细胞被转化，一些细 胞未被转化，因此需要筛选出被转化的宿 主细胞。筛选可利用载体的遗传标志，如 抗菌素抗性等来进行选择。
5.鉴别特定重组克隆 由于种种因素的影响，筛 选出来的并不一定是真正转化的细胞，需要作进 一步鉴定，可用核酸杂交、免疫化学法等。另外， 由于整合部位等位置效应，外源DNA在宿主细胞 内的表达强度等也不同，还需要进一步弄清目的 克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主 要有酶切图谱的制定、基因在DNA片段上的精确 定位、确定是否含有内含子、DNA序列分析、离 体翻译实验、外源基因在宿主细胞中的表达及产 物提纯等。
藻类基因工程作为基因工程的一个分支，相应地 包括以下几个主要步骤: 1.获得带有目的基因的DNA片断 用限制性内切 酶切割生物染色体DNA，得到大小不同的DNA片 段，其中的某一片段上可能刚好有所需要的目的 基因;以mRNA为模板，用反转录酶进行反转录合 成互补DcD合成法直接合 成某个基因。
二、天然转化与诱导转化
天然转化是指蓝藻在指数生长期不经过处理直 接吸纳外源DNA。聚球藻是首次报道的可天然转 化的藻株（Shestakov和Khuyen，1970）。目前 发现的可天然转化的蓝藻绝大多数属于聚球藻和 集胞藻两个属。蓝藻天然转化的机制虽不太清楚， 但估计绝大多数单细胞品系可能具有天然感受态， 其机制可能与细菌具有相似之处。 诱导转化是指通过人工诱导感受态进行遗传转 化，如Ca2+可有效诱导集胞藻感受态的形成。
真核藻类(eukaryotic algae)基因工程起始于80年代， Rochaix和Dillewjin(1983)第一个报道了他们利用 质 粒 为 载 体 对 单 细 胞 绿 藻 ——— 莱 茵 衣 藻 (Chlamydomonas reinhardi Dang)进行基因转移的 研究。随着真核藻类基因工程研究的广泛深入， 目前衣藻已成为叶绿体、线粒体与染色体三套基 因组均能遗传转化的藻类。除衣藻外，椭圆小球 藻(Chlorella ellipsoidea Gern.)也正在成为另一个单 细胞绿藻转化系统，目前已对20余种红藻进行了 研究，在14种红藻中发现有质粒，数目一至多个 不等。近两年来，在一些经济藻类如钝顶螺旋藻 (Spirulina platensis)、真江蓠(Gracilaria asiatica)中 也发现了质粒。真核藻类特别是一些经济藻类质 粒的发现，为真核藻类基因工程提供了潜在的载 体，对藻类基因工程的发展具有积极意义。