微生物检验技术培训精品PPT课件
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《微生物检验技术》课件
食品中常见的微生物种类：细菌 、霉菌、酵母菌等。
微生物在食品中的分布特点：食 品的种类、加工方式、储存条件 等对微生物的分布有显著影响。
微生物的来源：食品生产、加工 、运输、储存等环节中可能引入
的微生物。
食品中微生物的检测方法与操作
01
02
03
04
传统检测方法
培养法、镜检法等。
现代检测技术
免疫分析法、PCR技术、生物 传感器等。
消毒灭菌效果的监测
对医院环境、医疗器械等进行 微生物学检测，评估消毒灭菌 效果，确保医疗安全。
抗菌药物敏感性试验
通过抗菌药物敏感性试验，指 导临床医生合理选用抗菌药物 ，降低耐药性的产生。
感染暴发调查
在发生医院感染暴发时，进行 流行病学调查和溯源分析，查 找感染源和传播途径，采取有
效控制措施。
疫苗的研究与开发
病原微生物的分离与鉴定
从患者体内分离出病原微生物，并进行鉴定，为疫苗的研制提供基础 资料。
疫苗株的筛选
通过微生物检验技术对病原微生物进行筛选，选择适合作为疫苗株的 菌株或病毒株。
疫苗制备过程的监控
在疫苗制备过程中，对原材料、半成品和成品进行质量检验和安全性 评估，确保疫苗的安全性和有效性。
疫苗效果评价
微生物的生长与繁殖
微生物的生长
微生物生长是指微生物细胞数目的增加和质量的增加。其生 长过程分为迟缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期。
微生物的繁殖
微生物繁殖是微生物生长的必然结果，繁殖方式包括二分裂 、出芽生殖、孢子生殖等。繁殖过程中，微生物的遗传物质 会复制并传递给后代。
微生物的生理生化特性
微生物的代谢
利用微生物降解污染物，处理废水、废气等，降低环境污染。
医学检验微生物ppt课件完整版x
个人防护措施及注意事项说明
实验服与护目镜
进入实验室需穿着实验服，佩戴合适的护目镜， 防止试剂飞溅或粉尘刺激。
手套与口罩
根据实验需要选择合适的手套和口罩，避免皮肤 接触有害试剂或吸入有害气体。
实验操作规范
规范实验操作，避免产生气溶胶或飞溅物，减少 交叉污染的风险。
实验废弃物处理及环保要求讲解
废弃物分类处理
医学检验微生物ppt课件完 整版x
目录
• 微生物学基础 • 医学微生物学概述 • 常见病原微生物介绍 • 微生物检验技术与方法 • 临床标本中常见病原微生物检测实例分析 • 实验室安全与防护措施
01 微生物学基础
微生物定义与分类
微生物定义
微生物是一类形体微小、结构简单、 必须借助光学显微镜或电子显微镜 才能看到的微小生物。
微生物生长与繁殖
01
微生物营养
微生物从外界环境中摄取和利用营养物质的过程称为营养。微生物营养
类型有光能自养型、光能异养型、化能自养型和化能异养型四类。
02 03
微生物生长
微生物在适宜的环境条件下，通过摄取营养物质、合成细胞物质、增加 细胞数量的过程称为生长。生长曲线可分为迟缓期、对数期、稳定期和 衰亡期四个时期。
通过对微生物基因组进行测序和 分析，了解其基因组成和功能， 为微生物的鉴定和分型提供准确
依据。
基因芯片技术
将大量特异性基因探针固定在芯 片上，通过与待测微生物DNA杂
交来鉴定其种类和型别。
宏基因组学技术
通过对环境中所有微生物的基因 组进行高通量测序和分析，了解 微生物群落的组成和功能，为环 境微生物检测和生态学研究提供
尿液标本中常见病原微生物检测实例分析
尿常规检查
微生物检验技术培训PPT课件
17
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•无菌检查法包括
• 薄膜过滤法 • 直接接种法
•只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。 •供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适 用性试验确认的方法相同。 •无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂 等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
3d
培养基
生孢梭菌
空白
1支
枯草芽孢杆菌
各2支 胰酪大豆胨液体
白色念珠菌 黑曲霉
培养基
20～25℃
5d
【10版：改良
马丁培养基】
结空果白判定:
1支
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏
度检查符合规定。
16
第16页/共80页
二、无菌检查
3.方法适用性试验（方法验证试验）
•当 进 行 产 品 无 菌 检 查 法 时 ， 应 进 行 方 法 适 用 性 试 验 ， 以 确 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进 行方法适用性试验。 •验 证 时 ， 按 “ 供 试 品 的 无 菌 检 查 ” 的 规 定 及 下 列 要 求 进 行 操 作 。 对 每 一 试 验 菌 应 逐一进行验证。 •方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。
24
第24页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结 果 判 断
• 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： • （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法的要求。 • （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素。 • （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌 试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•无菌检查法包括
• 薄膜过滤法 • 直接接种法
•只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。 •供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适 用性试验确认的方法相同。 •无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂 等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
3d
培养基
生孢梭菌
空白
1支
枯草芽孢杆菌
各2支 胰酪大豆胨液体
白色念珠菌 黑曲霉
培养基
20～25℃
5d
【10版：改良
马丁培养基】
结空果白判定:
1支
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏
度检查符合规定。
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二、无菌检查
3.方法适用性试验（方法验证试验）
•当 进 行 产 品 无 菌 检 查 法 时 ， 应 进 行 方 法 适 用 性 试 验 ， 以 确 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进 行方法适用性试验。 •验 证 时 ， 按 “ 供 试 品 的 无 菌 检 查 ” 的 规 定 及 下 列 要 求 进 行 操 作 。 对 每 一 试 验 菌 应 逐一进行验证。 •方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结 果 判 断
• 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： • （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法的要求。 • （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素。 • （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌 试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
微生物检测培训PPT课件
实验室必须是微生物实验专用
实验室应分为准备区域和测试区域. 湿热灭菌锅, 作为这两个区域的典型的分 隔(门). 这种分隔保证了能有效使用无菌技术并帮助防止培养基和样品的交叉 污染. 假如两个区域无法分开, 实验室应根据实验准备和测试两个行为来区分不 同的区域.
2/24/2020
13
第五章
2/24/2020
17
第六章
GLP要点 – 工作区域
样品采集工具
未使用培养皿
已使用培养皿
样品和器皿
2/24/2020
工作区域
已使用器皿
桌面安放实例
18
第六章
GLP要点 – 洁净工作台
简介
使用
监控
洁净工作台提供了控制来自环境的污 染并提供工作区域的洁净空气. 洁净空 气吹向工作区域, 同时, 可以避免外部 空气进入工作区域
假如你有长发, 应盘起或夹住以避免发尾接触培养基或者样品. 有些实验室需要发帽来避 免可能污染, 不要在实验室梳头.
并致病; 假如含有致病菌可能
存区域, 盖子必须盖紧
• 用含有消毒剂的纸巾清洁工
会产生公共卫生的事件.
作台面.
• 最好废弃物能够进行湿热灭
菌
2/24/2020
12
第五章
实验室布局
一个设计合理的实验室能提供一个合格的环境以支持实验能够安全有效地进 行. 首先, 需要为实验室选择一个合适的物理位置: 远离其他操作区域, 比如, 生产或者储运 没有从其他区域进入实验室的直接入口
多余的培养皿, 烧瓶或者滤纸可能会干扰实验并带来潜在的溅出, 打碎或者交叉污染.
在配制培养基或者开始试验前, 应该清洁并消毒工作桌面. 最佳的消毒剂是70%的酒精溶 液, 含氯水的溶液, 或者公司批准的其他消毒剂. 最好使用一次性的消毒纸巾, 不能使用毛 巾或者海绵. 清洁后, 应等待几分钟以使有充分的时间杀灭微生物, 可以用纸巾擦干.
实验室应分为准备区域和测试区域. 湿热灭菌锅, 作为这两个区域的典型的分 隔(门). 这种分隔保证了能有效使用无菌技术并帮助防止培养基和样品的交叉 污染. 假如两个区域无法分开, 实验室应根据实验准备和测试两个行为来区分不 同的区域.
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第五章
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第六章
GLP要点 – 工作区域
样品采集工具
未使用培养皿
已使用培养皿
样品和器皿
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工作区域
已使用器皿
桌面安放实例
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第六章
GLP要点 – 洁净工作台
简介
使用
监控
洁净工作台提供了控制来自环境的污 染并提供工作区域的洁净空气. 洁净空 气吹向工作区域, 同时, 可以避免外部 空气进入工作区域
假如你有长发, 应盘起或夹住以避免发尾接触培养基或者样品. 有些实验室需要发帽来避 免可能污染, 不要在实验室梳头.
并致病; 假如含有致病菌可能
存区域, 盖子必须盖紧
• 用含有消毒剂的纸巾清洁工
会产生公共卫生的事件.
作台面.
• 最好废弃物能够进行湿热灭
菌
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第五章
实验室布局
一个设计合理的实验室能提供一个合格的环境以支持实验能够安全有效地进 行. 首先, 需要为实验室选择一个合适的物理位置: 远离其他操作区域, 比如, 生产或者储运 没有从其他区域进入实验室的直接入口
多余的培养皿, 烧瓶或者滤纸可能会干扰实验并带来潜在的溅出, 打碎或者交叉污染.
在配制培养基或者开始试验前, 应该清洁并消毒工作桌面. 最佳的消毒剂是70%的酒精溶 液, 含氯水的溶液, 或者公司批准的其他消毒剂. 最好使用一次性的消毒纸巾, 不能使用毛 巾或者海绵. 清洁后, 应等待几分钟以使有充分的时间杀灭微生物, 可以用纸巾擦干.
微生物检测技术PPT
采样所出的问题
食品微生物检验的样品送检
采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要 因送检过程而引起微生物的减少或增多。
无菌方法采样后，所装样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境 中的微生物进一步污染； 进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。若路途 遥远，可将不需冷冻的样品，保持在1～5 ℃环境中送检，可采用冰桶等装置； 若需保持在冷冻状态（如已冰冻的样品），则需将样品保存在泡沫塑料隔热 箱内，箱内可置干冰，使温度维持在0℃以下，或采用其他冷藏设备； 送检样品不得加入任何防腐剂； 水产品因含水分较多，体内酶的活力较旺盛，易于变质。因此，采样后应在 3h内送检，在送检途中一般都应加冰保存； 对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。 检样标注适当的标记并填写微生物学检验特殊要求的送检申请单。其内容包 括：样品的描述，采样者的姓名，采样的日期、时间、地点，采样时的温度 和湿度等
微生物的培养
－－微生物培养中的氧气条件
培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇 床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养 或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或 生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条 件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌 氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用 的如葡萄糖——美兰指示剂。
（5）生产工序监测采样
•
车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部 位用100ml无菌注射器抽取。
微生物检验 PPT课件
技术逐渐推 广应用
第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物
二、基本原理
抗体与荧光素结合后，并不影响其和相应抗原
发生特异性结合反应，事先将待测抗原固定于载玻
片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应 抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，在 荧光显微镜下可观察到荧光，否则荧光抗体被缓冲 液冲掉，在荧光显微镜下观察不到荧光。
四乙基罗丹明 (RB200) 570
四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 550
最大发射 光波长
520～530
595～600
620
荧光颜色
黄绿色
橘红色
橙红色
4.荧光抗体的制备
荧光抗体的制备程序： 制备免疫血清或McAb ↓ 抗体纯化 ↓ 抗体标记： 搅拌法、透析法 方法 ↓ 标记物提纯：去除游离荧光素 去除过度标记或未结合抗体 ↓ 标记物鉴定：含量、特异性、效价、F/P 鉴定 ↓ 实际应用
3.荧光色素的要求
（1）应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基因 （2） 荧光效率高 （3）荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明 （4）与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质 （5）标记方法简单，安全无毒 （6）与蛋白质的结合物稳定，易于保存
异硫氰酸荧光素 ( FITC) 最大吸收 光波长 490～495
第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物
经典的免疫分析技术
凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合实验 特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实 现自动化。
现代的免疫分析技术
荧光免疫标记、放射性免疫标记、酶免疫标记、镧系 （稀土）元素免疫标记、临床化学免疫分析技术、发光免 疫标记、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。 特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。
微生物检验技术 PPT课件
菌种保藏的目的： 防止优良性状菌种的退化或变异。 注意：在实际工作中菌种的退化或变异是 难以避免的。微生物的遗传与变异是正常 的生物进化规律，变异是绝对的，稳定性 是相对的。
（一）菌种保藏的目的和意义
菌种保藏的意义： 微生物菌种是珍贵的自然资源，通过 分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须 通过各种保藏技术使其在一定时间内不死 亡，不会被其他微生物污染，不会因发生 变异而丢失重要的生物学性状，否则就无 法真正保证微生物研究和应用工作的顺利 进行。因此，菌种或培养物保藏是一项最 重要的微生物学基础工作，具有重要意义。
（四） 菌种的衰退与复壮
2、菌种衰退的实质
菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量 变到质变的逐步演变过程。 注意：开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生 负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而 一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例 逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个 群体表现出严重的衰退。 所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中 已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后 来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的， 即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。
（四） 菌种的衰退与复壮
1、菌种衰退的表现 2、菌种衰退的实质 3、菌种的复壮
（四） 菌种的衰退与复壮
1、菌种衰退的表现
（1）生长速度缓慢，产孢子越来越少。 （2）代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下 降。 （3）其他原有的典型性状变得不典型，如：最易 觉察到的是菌落和细胞形态的改变。 （4）对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。 （5）抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能 力的减弱等。
Байду номын сангаас
（三）菌种保藏的方法
2、冷冻干燥保藏法 将微生物或孢子冷冻，然后在减压情 况下利用升华现象除去水分，使细胞的代 谢、生理等生命活动处在停止状态下进行 长期保藏。
（一）菌种保藏的目的和意义
菌种保藏的意义： 微生物菌种是珍贵的自然资源，通过 分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须 通过各种保藏技术使其在一定时间内不死 亡，不会被其他微生物污染，不会因发生 变异而丢失重要的生物学性状，否则就无 法真正保证微生物研究和应用工作的顺利 进行。因此，菌种或培养物保藏是一项最 重要的微生物学基础工作，具有重要意义。
（四） 菌种的衰退与复壮
2、菌种衰退的实质
菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量 变到质变的逐步演变过程。 注意：开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生 负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而 一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例 逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个 群体表现出严重的衰退。 所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中 已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后 来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的， 即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。
（四） 菌种的衰退与复壮
1、菌种衰退的表现 2、菌种衰退的实质 3、菌种的复壮
（四） 菌种的衰退与复壮
1、菌种衰退的表现
（1）生长速度缓慢，产孢子越来越少。 （2）代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下 降。 （3）其他原有的典型性状变得不典型，如：最易 觉察到的是菌落和细胞形态的改变。 （4）对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。 （5）抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能 力的减弱等。
Байду номын сангаас
（三）菌种保藏的方法
2、冷冻干燥保藏法 将微生物或孢子冷冻，然后在减压情 况下利用升华现象除去水分，使细胞的代 谢、生理等生命活动处在停止状态下进行 长期保藏。
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特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻 片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将 载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织 细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。
检测特定生物有机体之间是否存在 亲缘关系
1.待检菌株的DNA双链 2.用碱或热变性使双链解开（DNA的变性） 3. 将单链DNA在硝酸纤维素膜上的固定 4.加放射性标记的DNA或RNA 5.保温（一般是66℃，24h）进行互补碱基配
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、
拷贝数及表达丰度。
杂交的类型
（1）按杂交对象：
DNA-DNA RNA-DNA
（2）按作用环境：
固相杂交：是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支 持物上，一条反应核酸（标记探针）游离在溶液中。
二、核酸探针的工作原理
两条碱基互补的DNA链在适当条件下按碱 基配对原则形成杂交DNA分子。根据DNA遗 传序列的相对稳定性和互补原则，用已知特异 的碱基序列作成有标记的一小段单链(或核苷 酸序列)与被检测材料进行分子杂交。如果被 检测材料中病原的遗传序列与探针具有互补的 碱基序列，就会形成杂交双链，从而证明它们 之间具有一定程度的同源性。（p108）
感器的探针利用
第二节 PCR技术检测微生物
一、 PCR反应的基本原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)就是模板DNA、引物以及四种脱氧核糖核 苷三磷酸(dNTPs )在DNA聚合酶的催化作用下 所发生的酶促聚合反应，PCR反应是由变性--退 火--延伸三个基本反应步骤构成的。
对（杂交） 6.用缓冲溶液洗脱未杂交的部分 7.测定膜的放射性，计算杂交率
检测特定生物有机体之间是否存在 亲缘关系
1.待检菌株的DNA双链 2.用碱或热变性使双链解开（DNA的变性） 3. 将单链DNA在硝酸纤维素膜上的固定 4.加放射性标记的DNA或RNA 5.保温（一般是66℃，24h）进行互补碱基配
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、
拷贝数及表达丰度。
杂交的类型
（1）按杂交对象：
DNA-DNA RNA-DNA
（2）按作用环境：
固相杂交：是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支 持物上，一条反应核酸（标记探针）游离在溶液中。
二、核酸探针的工作原理
两条碱基互补的DNA链在适当条件下按碱 基配对原则形成杂交DNA分子。根据DNA遗 传序列的相对稳定性和互补原则，用已知特异 的碱基序列作成有标记的一小段单链(或核苷 酸序列)与被检测材料进行分子杂交。如果被 检测材料中病原的遗传序列与探针具有互补的 碱基序列，就会形成杂交双链，从而证明它们 之间具有一定程度的同源性。（p108）
感器的探针利用
第二节 PCR技术检测微生物
一、 PCR反应的基本原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)就是模板DNA、引物以及四种脱氧核糖核 苷三磷酸(dNTPs )在DNA聚合酶的催化作用下 所发生的酶促聚合反应，PCR反应是由变性--退 火--延伸三个基本反应步骤构成的。
对（杂交） 6.用缓冲溶液洗脱未杂交的部分 7.测定膜的放射性，计算杂交率
微生物检验培训ppt(化妆品微生物检验技术)
“不可计”
“不可计”注明稀释度
九、关于TTC
为便于区别化妆品中的颗粒与菌 落，可在每 100mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5％的 TTC 溶液，如有细菌存在，培养 后菌落呈红色，而化妆品的颗粒 颜色无变化。
TTC亦不可多加会抑制菌落生 长
GB15979-2002
九、一次性卫生用品卫生标准
样品放置
应置于室温阴凉干燥 处，不要冷藏或冷冻。
不复测
严格上微生物无复 测一说，因此对微 生物检验人员要求
严格。
八、详细操作步骤重点
培养基配制
所配制培养基可冷藏 和冷却备用为分步骤 检测提供基础。
单位
菌落总数和霉菌酵母 菌总数单位CFU/g或 CFU/ml。
有效数字
二位有效数字，在二 位有效数字后面的数 值，应以四舍五入法 计算。
• 此外还能液化明胶，还原 硝酸盐为亚硝酸盐，在 42℃± 1℃条件下能生长。 该菌对人有致病力，可使 伤处化脓，引起败血症等。 在自然界中分布甚广，空 气、水、土壤。
金黄色葡萄球菌
检验周期：未检出2天，检出3天
• 为革兰氏阳性球菌，呈葡 萄状排列，无芽胞，无荚 膜，能分解甘露醇，血浆 凝固酶阳性。
• 该菌是葡萄球菌中对人类 致病力最强的一种，能引 起人体局部化脓性病灶， 严重时可导致败血症。
四、供检样品的制备
五、化妆品中常用的中和剂
1.化妆品安全技术规范：培养基成分中直接有卵磷脂 （1g）吐温80（7g）。（稀释法也能同步起到中和的 效果） 2.国际方法：尼泊金酯类防腐剂的中和剂：吐温80 （30g/L）和卵磷脂(3g/L)+普通肉汤。
六、细菌总数测试流程
供试液的制备
第十一章微生物培养检验技术 ppt课件
❖ 奶酪：用灭菌刀削去部分外表封蜡，再 用点燃的酒精棉球消毒外表后，用灭菌 刀切开后，用无菌刀取表层及深层检样 少许，置灭菌乳钵内捣碎，加少许生理 盐水调成糊状。
❖ 4、蛋及蛋制品 ❖ 〔1〕样品采集 ❖ 鲜蛋：用流水冲洗外壳，再用95%酒精棉球涂
擦消毒后，放入灭菌袋内，加封作好标志送检。
❖ 全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：将包装开口处用 75%酒精棉球消毒再开盖，用灭菌的金属制双 层螺旋式套管采样器斜角插入箱底，使套管旋 转收取检样，提出箱外用灭菌小匙自上、中、 下部取样，装入灭菌广口瓶中，每个检样不少 于100克。
❖ 二、真菌学检验
❖ 〔一〕霉菌的测定
❖ 1、稀释培育法
❖ 测全菌 固样——捣碎稀释
❖
粉样、流体样——混合稀释
❖ 2、显微镜直接镜检法
❖ ①血球计数器计数法
❖ ②视野计数法
❖ 吸管、载片、盖玻等彻底消毒，用吸管准确测出1ml 菌液的滴数，并滴一滴于载玻片上，盖盖玻片〔菌液不 外溢或发生气泡〕，在显微镜下按以下顺序检视10个视 野，记录每个视野菌数，求出平均数，再用测微尺测定 视野直径，求出视野面积，同时算出盖玻片面积，那么：
❖ 二、样品的微生物镜检 ❖ 直接对样品进展镜检。 ❖ 三、培育检验 ❖ 〔一〕培育基的选择 ❖ 细菌 肉汤蛋白胨培育基 ❖ 酵母 用酵母菌培育基 ❖ 霉菌 用霉菌培育基并参与细菌抑制剂
〔孟加拉红70mg/100ml或链霉素 4000μg/100ml〕 ❖ 放线菌 用高氏一号培育基
❖ 〔二〕培育检验方法 ❖ 1、种植培育 ❖ 〔1〕方法：适用于粒状或块状试样的全菌和
❖ ③捣碎稀释 用组织捣碎器或研钵将定量无菌 水捣碎，试样经外表消毒后也可作内部菌分析。
❖ 〔2〕菌落计数
❖ 4、蛋及蛋制品 ❖ 〔1〕样品采集 ❖ 鲜蛋：用流水冲洗外壳，再用95%酒精棉球涂
擦消毒后，放入灭菌袋内，加封作好标志送检。
❖ 全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：将包装开口处用 75%酒精棉球消毒再开盖，用灭菌的金属制双 层螺旋式套管采样器斜角插入箱底，使套管旋 转收取检样，提出箱外用灭菌小匙自上、中、 下部取样，装入灭菌广口瓶中，每个检样不少 于100克。
❖ 二、真菌学检验
❖ 〔一〕霉菌的测定
❖ 1、稀释培育法
❖ 测全菌 固样——捣碎稀释
❖
粉样、流体样——混合稀释
❖ 2、显微镜直接镜检法
❖ ①血球计数器计数法
❖ ②视野计数法
❖ 吸管、载片、盖玻等彻底消毒，用吸管准确测出1ml 菌液的滴数，并滴一滴于载玻片上，盖盖玻片〔菌液不 外溢或发生气泡〕，在显微镜下按以下顺序检视10个视 野，记录每个视野菌数，求出平均数，再用测微尺测定 视野直径，求出视野面积，同时算出盖玻片面积，那么：
❖ 二、样品的微生物镜检 ❖ 直接对样品进展镜检。 ❖ 三、培育检验 ❖ 〔一〕培育基的选择 ❖ 细菌 肉汤蛋白胨培育基 ❖ 酵母 用酵母菌培育基 ❖ 霉菌 用霉菌培育基并参与细菌抑制剂
〔孟加拉红70mg/100ml或链霉素 4000μg/100ml〕 ❖ 放线菌 用高氏一号培育基
❖ 〔二〕培育检验方法 ❖ 1、种植培育 ❖ 〔1〕方法：适用于粒状或块状试样的全菌和
❖ ③捣碎稀释 用组织捣碎器或研钵将定量无菌 水捣碎，试样经外表消毒后也可作内部菌分析。
❖ 〔2〕菌落计数
食品微生物检测PPT培训课件
食品微生物检测PPT
4
二、糖醇类代谢试验
（一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验 MR （五）七叶苷水解试验 （六）甘油品红试验
2/7/2021
食品微生物检测PPT
5
（一） 糖醇类发酵试验
1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及 所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种 糖醇），有的只能分解1~2种糖醇 ，有的分 解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不 产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
2/7/2021
食品微生物检测PPT
17
（3）快速法：
将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸 反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化 接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化 钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。 不产酸的培养物不能使用。
2/7/2021
食品微生物检测PPT
18
3、结果观察与记录
（1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P+ （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P-
2/7/2021
食品微生物检测PPT
Hale Waihona Puke 19（四）甲基红试验（MR）
1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途 径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋 酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5 以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有 的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液 pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
产碱型 不产酸（绿色） 不产酸（绿色）
2/7/2021
食品微生物检测PPT
微生物检验ppt课件(2024)
涂布分离法
将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2024/1/29
19
革兰氏染色技术
初染
涂片固定后，滴加结晶 紫染色液覆盖涂片，染 色1分钟，然后水洗。
2024/1/29
媒染
脱色
复染
滴加卢戈氏碘液覆盖涂 片，媒染1分钟，然后水
洗。
用95%乙醇脱色30秒至 1分钟，然后水洗。
22
04
定期对实验室环境和设 备进行清洁、消毒和维 护，确保其功能正常
实验人员的素质与技能要求
01
02
03
04
具备微生物学、医学、检验学 等相关专业的背景和知识
熟悉微生物检验的基本原理、 方法和技术
掌握实验室安全知识和操作技 能，如生物安全防护、废弃物
处理等
具备良好的职业道德和团队协 作精神，能够认真负责地完成
及时向上级主管部门或相关方报告实验结果，并提供必 要的技术支持和建议
对实验结果进行客观、准确的评价和解释，避免主观臆 断和误导
对实验过程中出现的问题和异常情况进行及时汇报和处 理，确保实验质量和安全
2024/1/29
25
06
微生物检验的挑战与发展趋势
2024/1/29
26
微生物检验面临的挑战与问题
微生物多样性
微生物种类繁多，形态各异，对检验技术的要求极高。
2024/1/29
检验灵敏度与特异性
传统微生物检验方法灵敏度低，特异性差，难以满足临床和科研 需求。
耐药性问题
随着抗生素的广泛使用，耐药微生物逐渐增多，对检验技术提出 了更高的要求。
27
新技术在微生物检验中的应用与展望
将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
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革兰氏染色技术
初染
涂片固定后，滴加结晶 紫染色液覆盖涂片，染 色1分钟，然后水洗。
2024/1/29
媒染
脱色
复染
滴加卢戈氏碘液覆盖涂 片，媒染1分钟，然后水
洗。
用95%乙醇脱色30秒至 1分钟，然后水洗。
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04
定期对实验室环境和设 备进行清洁、消毒和维 护，确保其功能正常
实验人员的素质与技能要求
01
02
03
04
具备微生物学、医学、检验学 等相关专业的背景和知识
熟悉微生物检验的基本原理、 方法和技术
掌握实验室安全知识和操作技 能，如生物安全防护、废弃物
处理等
具备良好的职业道德和团队协 作精神，能够认真负责地完成
及时向上级主管部门或相关方报告实验结果，并提供必 要的技术支持和建议
对实验结果进行客观、准确的评价和解释，避免主观臆 断和误导
对实验过程中出现的问题和异常情况进行及时汇报和处 理，确保实验质量和安全
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微生物检验的挑战与发展趋势
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微生物检验面临的挑战与问题
微生物多样性
微生物种类繁多，形态各异，对检验技术的要求极高。
2024/1/29
检验灵敏度与特异性
传统微生物检验方法灵敏度低，特异性差，难以满足临床和科研 需求。
耐药性问题
随着抗生素的广泛使用，耐药微生物逐渐增多，对检验技术提出 了更高的要求。
27
新技术在微生物检验中的应用与展望
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微生物检验技术
1
微生物检验技术
一、环境监测 二、无菌检查 三、微生物限度检查
2
一、环境监测
无菌检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
无菌检查：
无菌检查：
应在洁净度
应在洁净度B级背
10000级背景下的局部100 景下的局部A级单向流空气
级单向流空气区域内或隔 区域内或隔离系统中进行
50
－
5
一、环境监测
药品洁净实验室监测项目及频次（参考）
受控区域
洁净度级别
无菌隔离系统 内部
采样频次 每次实验
相邻外部
每月一次
微生物洁净实 无菌检查（以A/B级或 每次实验
验室
A/C级为例）
微生物限度检查以A/C 每周一次
级为例）
C级
每季度一次
D级
每半年一次
监测项目 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物
② 灵敏度检查
菌种
• 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥 菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试 验菌株的生物学特性。
• 菌液：浓度<100cfu/ml • 接种：2管+菌液，1管空白 • 结果判断：+菌液----生长良好
空白----无菌生长
15
二、无菌检查
微生物限度检查：
应在洁净度10000级背
应在受控环境下（不
景下的局部100级单向流空 低于D级）的局部不低于B
气区域内进行。
级单向流空气区域内进行。
4
一、环境监测
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
表面微生物
洁净度 级别
静态
≥0.5μ ≥5.0
m
μm(2)
A级 3520 20
7
二、无菌检查
1. 总则：环境、设备、人员 2. 培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查 3. 方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法 4. 供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、直接接种
法、薄膜过滤法、培养及观察 5. 结果判断
8
二、无菌检查
1.总则 1）对象：
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、 医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检 验条件下未发现微生物污染。
2灵敏度检查
菌液制备: 取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基 【 1 0 版：营养肉汤培养基或营养 琼脂培养基 】
硫乙醇酸盐流体培养基
30~35℃
18h~24 h
白色念珠菌
沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基
24h~48
【 1 0 版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
6
一、环境监测
培养基 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 细菌、酵母菌和霉菌的生长必要时可加入添 加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。， 沙氏葡萄糖琼脂(SDA)（当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时）
培养时间： ChP(2015)
TSA: SDA:
3-5天 5-7天
GB/T 16293-2010
不少于2天 不少于5天
基】
h 【10版
上制黑述成曲培每霉1养ml物含用菌pH数7.小0于沙或版无1氏用：菌00葡适改氯c萄宜良化fu糖方马钠的琼法丁-菌蛋脂制琼悬白斜成脂液胨面孢斜。缓培子面冲养悬培液基液养或基【0】1.90%无：℃菌2】3氯-2化8钠5溶d~液7d
13
二、无菌检查
2）培养基适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培 养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同 时进行。
14
二、无菌检查
2）培养基适用性检查
① 无菌性检查:
• 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶） ，置各培养基规定的温度培 养 14天，应无菌生长。
10
二、无菌检查
3）人员：
【10版：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。】 15版删除。
11
二、无菌检查
2、培养基
内
2010版
容
培 硫乙醇酸盐流体培养基
养 改良马丁培养基 系 选择性培养基 统
0.5%葡萄糖肉汤培养基
营养肉汤培养基
营养琼脂培养基
改良马丁琼脂培养基
2015版
硫乙醇酸盐流体培养基 胰酪大豆胨液体培养基 中和或灭活用培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基
12
二、无菌检查
2.培பைடு நூலகம்基
硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也 可用于需气菌培养。 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 适 用 于 真 菌 和 需 气 菌 的 培 养 。 1）培养基的制备及培养条件
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境 若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器 中，一般可在一年内使用。
动态
≥0.5 μm
3520
≥5.0 μm
20
浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
cfu /4 小时(2)
接触 （）
cfu / 碟
5指手 套
cfu / 手套
1
1
1
1
B级
3520 29 35200 2900
0
10
5
5
5
C级
35200 290
0
0
2900
0
100
50
25
－
D级
290 不作规 不作规
00
定
定
200 100
9
二、无菌检查
2）环境：
应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求， （ 《9203 药品微生物实验室质量管理指导原则》:环境洁净度B 级 背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行） 【 10版：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 气区域内或隔离系统中进行】，其全过程应严格遵守无菌操作，防止 微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 A 级和 B 级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA） 。
离系统中进行。
。
修订依据及意义：2010版GMP附录一«无菌药品»和附录三«生物制品»中均 规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级。无菌检 查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！
3
一、环境监测
微生物限度检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
微生物限度检查：
1
微生物检验技术
一、环境监测 二、无菌检查 三、微生物限度检查
2
一、环境监测
无菌检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
无菌检查：
无菌检查：
应在洁净度
应在洁净度B级背
10000级背景下的局部100 景下的局部A级单向流空气
级单向流空气区域内或隔 区域内或隔离系统中进行
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－
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一、环境监测
药品洁净实验室监测项目及频次（参考）
受控区域
洁净度级别
无菌隔离系统 内部
采样频次 每次实验
相邻外部
每月一次
微生物洁净实 无菌检查（以A/B级或 每次实验
验室
A/C级为例）
微生物限度检查以A/C 每周一次
级为例）
C级
每季度一次
D级
每半年一次
监测项目 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物
② 灵敏度检查
菌种
• 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥 菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试 验菌株的生物学特性。
• 菌液：浓度<100cfu/ml • 接种：2管+菌液，1管空白 • 结果判断：+菌液----生长良好
空白----无菌生长
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二、无菌检查
微生物限度检查：
应在洁净度10000级背
应在受控环境下（不
景下的局部100级单向流空 低于D级）的局部不低于B
气区域内进行。
级单向流空气区域内进行。
4
一、环境监测
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
表面微生物
洁净度 级别
静态
≥0.5μ ≥5.0
m
μm(2)
A级 3520 20
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二、无菌检查
1. 总则：环境、设备、人员 2. 培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查 3. 方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法 4. 供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、直接接种
法、薄膜过滤法、培养及观察 5. 结果判断
8
二、无菌检查
1.总则 1）对象：
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、 医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检 验条件下未发现微生物污染。
2灵敏度检查
菌液制备: 取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基 【 1 0 版：营养肉汤培养基或营养 琼脂培养基 】
硫乙醇酸盐流体培养基
30~35℃
18h~24 h
白色念珠菌
沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基
24h~48
【 1 0 版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
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一、环境监测
培养基 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 细菌、酵母菌和霉菌的生长必要时可加入添 加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。， 沙氏葡萄糖琼脂(SDA)（当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时）
培养时间： ChP(2015)
TSA: SDA:
3-5天 5-7天
GB/T 16293-2010
不少于2天 不少于5天
基】
h 【10版
上制黑述成曲培每霉1养ml物含用菌pH数7.小0于沙或版无1氏用：菌00葡适改氯c萄宜良化fu糖方马钠的琼法丁-菌蛋脂制琼悬白斜成脂液胨面孢斜。缓培子面冲养悬培液基液养或基【0】1.90%无：℃菌2】3氯-2化8钠5溶d~液7d
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二、无菌检查
2）培养基适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培 养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同 时进行。
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二、无菌检查
2）培养基适用性检查
① 无菌性检查:
• 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶） ，置各培养基规定的温度培 养 14天，应无菌生长。
10
二、无菌检查
3）人员：
【10版：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。】 15版删除。
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二、无菌检查
2、培养基
内
2010版
容
培 硫乙醇酸盐流体培养基
养 改良马丁培养基 系 选择性培养基 统
0.5%葡萄糖肉汤培养基
营养肉汤培养基
营养琼脂培养基
改良马丁琼脂培养基
2015版
硫乙醇酸盐流体培养基 胰酪大豆胨液体培养基 中和或灭活用培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基
12
二、无菌检查
2.培பைடு நூலகம்基
硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也 可用于需气菌培养。 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 适 用 于 真 菌 和 需 气 菌 的 培 养 。 1）培养基的制备及培养条件
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境 若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器 中，一般可在一年内使用。
动态
≥0.5 μm
3520
≥5.0 μm
20
浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
cfu /4 小时(2)
接触 （）
cfu / 碟
5指手 套
cfu / 手套
1
1
1
1
B级
3520 29 35200 2900
0
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5
5
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C级
35200 290
0
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D级
290 不作规 不作规
00
定
定
200 100
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二、无菌检查
2）环境：
应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求， （ 《9203 药品微生物实验室质量管理指导原则》:环境洁净度B 级 背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行） 【 10版：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 气区域内或隔离系统中进行】，其全过程应严格遵守无菌操作，防止 微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 A 级和 B 级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA） 。
离系统中进行。
。
修订依据及意义：2010版GMP附录一«无菌药品»和附录三«生物制品»中均 规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级。无菌检 查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！
3
一、环境监测
微生物限度检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
微生物限度检查：