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微生物检验技术
1
微生物检验技术
一、环境监测 二、无菌检查 三、微生物限度检查
2
一、环境监测
无菌检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
无菌检查：
无菌检Fra Baidu bibliotek：
应在洁净度
应在洁净度B级背
10000级背景下的局部100 景下的局部A级单向流空气
级单向流空气区域内或隔 区域内或隔离系统中进行
基】
h 【10版
上制黑述成曲培每霉1养ml物含用菌pH数7.小0于沙或版无1氏用：菌00葡适改氯c萄宜良化fu糖方马钠的琼法丁-菌蛋脂制琼悬白斜成脂液胨面孢斜。缓培子面冲养悬培液基液养或基【0】1.90%无：℃菌2】3氯-2化8钠5溶d~液7d
10
二、无菌检查
3）人员：
【10版：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。】 15版删除。
11
二、无菌检查
2、培养基
内
2010版
容
培 硫乙醇酸盐流体培养基
养 改良马丁培养基 系 选择性培养基 统
0.5%葡萄糖肉汤培养基
营养肉汤培养基
营养琼脂培养基
改良马丁琼脂培养基
2015版
硫乙醇酸盐流体培养基 胰酪大豆胨液体培养基 中和或灭活用培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基
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二、无菌检查
2）环境：
应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求， （ 《9203 药品微生物实验室质量管理指导原则》:环境洁净度B 级 背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行） 【 10版：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 气区域内或隔离系统中进行】，其全过程应严格遵守无菌操作，防止 微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 A 级和 B 级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA） 。
离系统中进行。
。
修订依据及意义：2010版GMP附录一«无菌药品»和附录三«生物制品»中均 规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级。无菌检 查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！
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一、环境监测
微生物限度检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
微生物限度检查：
6
一、环境监测
培养基 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 细菌、酵母菌和霉菌的生长必要时可加入添 加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。， 沙氏葡萄糖琼脂(SDA)（当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时）
培养时间： ChP(2015)
TSA: SDA:
3-5天 5-7天
GB/T 16293-2010
不少于2天 不少于5天
微生物限度检查：
应在洁净度10000级背
应在受控环境下（不
景下的局部100级单向流空 低于D级）的局部不低于B
气区域内进行。
级单向流空气区域内进行。
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一、环境监测
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
表面微生物
洁净度 级别
静态
≥0.5μ ≥5.0
m
μm(2)
A级 3520 20
2灵敏度检查
菌液制备: 取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基 【 1 0 版：营养肉汤培养基或营养 琼脂培养基 】
硫乙醇酸盐流体培养基
30~35℃
18h~24 h
白色念珠菌
沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基
24h~48
【 1 0 版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
50
－
5
一、环境监测
药品洁净实验室监测项目及频次（参考）
受控区域
洁净度级别
无菌隔离系统 内部
采样频次 每次实验
相邻外部
每月一次
微生物洁净实 无菌检查（以A/B级或 每次实验
验室
A/C级为例）
微生物限度检查以A/C 每周一次
级为例）
C级
每季度一次
D级
每半年一次
监测项目 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物
动态
≥0.5 μm
3520
≥5.0 μm
20
浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
cfu /4 小时(2)
接触 （）
cfu / 碟
5指手 套
cfu / 手套
1
1
1
1
B级
3520 29 35200 2900
0
10
5
5
5
C级
35200 290
0
0
2900
0
100
50
25
－
D级
290 不作规 不作规
00
定
定
200 100
7
二、无菌检查
1. 总则：环境、设备、人员 2. 培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查 3. 方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法 4. 供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、直接接种
法、薄膜过滤法、培养及观察 5. 结果判断
8
二、无菌检查
1.总则 1）对象：
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、 医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检 验条件下未发现微生物污染。
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二、无菌检查
2.培养基
硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也 可用于需气菌培养。 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 适 用 于 真 菌 和 需 气 菌 的 培 养 。 1）培养基的制备及培养条件
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境 若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器 中，一般可在一年内使用。
② 灵敏度检查
菌种
• 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥 菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试 验菌株的生物学特性。
• 菌液：浓度<100cfu/ml • 接种：2管+菌液，1管空白 • 结果判断：+菌液----生长良好
空白----无菌生长
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二、无菌检查
13
二、无菌检查
2）培养基适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培 养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同 时进行。
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二、无菌检查
2）培养基适用性检查
① 无菌性检查:
• 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶） ，置各培养基规定的温度培 养 14天，应无菌生长。
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微生物检验技术
一、环境监测 二、无菌检查 三、微生物限度检查
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一、环境监测
无菌检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
无菌检查：
无菌检Fra Baidu bibliotek：
应在洁净度
应在洁净度B级背
10000级背景下的局部100 景下的局部A级单向流空气
级单向流空气区域内或隔 区域内或隔离系统中进行
基】
h 【10版
上制黑述成曲培每霉1养ml物含用菌pH数7.小0于沙或版无1氏用：菌00葡适改氯c萄宜良化fu糖方马钠的琼法丁-菌蛋脂制琼悬白斜成脂液胨面孢斜。缓培子面冲养悬培液基液养或基【0】1.90%无：℃菌2】3氯-2化8钠5溶d~液7d
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二、无菌检查
3）人员：
【10版：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。】 15版删除。
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二、无菌检查
2、培养基
内
2010版
容
培 硫乙醇酸盐流体培养基
养 改良马丁培养基 系 选择性培养基 统
0.5%葡萄糖肉汤培养基
营养肉汤培养基
营养琼脂培养基
改良马丁琼脂培养基
2015版
硫乙醇酸盐流体培养基 胰酪大豆胨液体培养基 中和或灭活用培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基
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二、无菌检查
2）环境：
应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求， （ 《9203 药品微生物实验室质量管理指导原则》:环境洁净度B 级 背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行） 【 10版：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 气区域内或隔离系统中进行】，其全过程应严格遵守无菌操作，防止 微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 A 级和 B 级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA） 。
离系统中进行。
。
修订依据及意义：2010版GMP附录一«无菌药品»和附录三«生物制品»中均 规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级。无菌检 查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！
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一、环境监测
微生物限度检查实验环境的修订
2010年版
2015年版（原修订稿）
微生物限度检查：
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一、环境监测
培养基 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 细菌、酵母菌和霉菌的生长必要时可加入添 加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。， 沙氏葡萄糖琼脂(SDA)（当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时）
培养时间： ChP(2015)
TSA: SDA:
3-5天 5-7天
GB/T 16293-2010
不少于2天 不少于5天
微生物限度检查：
应在洁净度10000级背
应在受控环境下（不
景下的局部100级单向流空 低于D级）的局部不低于B
气区域内进行。
级单向流空气区域内进行。
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一、环境监测
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
表面微生物
洁净度 级别
静态
≥0.5μ ≥5.0
m
μm(2)
A级 3520 20
2灵敏度检查
菌液制备: 取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基 【 1 0 版：营养肉汤培养基或营养 琼脂培养基 】
硫乙醇酸盐流体培养基
30~35℃
18h~24 h
白色念珠菌
沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基
24h~48
【 1 0 版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
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一、环境监测
药品洁净实验室监测项目及频次（参考）
受控区域
洁净度级别
无菌隔离系统 内部
采样频次 每次实验
相邻外部
每月一次
微生物洁净实 无菌检查（以A/B级或 每次实验
验室
A/C级为例）
微生物限度检查以A/C 每周一次
级为例）
C级
每季度一次
D级
每半年一次
监测项目 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物
动态
≥0.5 μm
3520
≥5.0 μm
20
浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
cfu /4 小时(2)
接触 （）
cfu / 碟
5指手 套
cfu / 手套
1
1
1
1
B级
3520 29 35200 2900
0
10
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C级
35200 290
0
0
2900
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D级
290 不作规 不作规
00
定
定
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二、无菌检查
1. 总则：环境、设备、人员 2. 培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查 3. 方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法 4. 供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、直接接种
法、薄膜过滤法、培养及观察 5. 结果判断
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二、无菌检查
1.总则 1）对象：
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、 医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检 验条件下未发现微生物污染。
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二、无菌检查
2.培养基
硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也 可用于需气菌培养。 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 适 用 于 真 菌 和 需 气 菌 的 培 养 。 1）培养基的制备及培养条件
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境 若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器 中，一般可在一年内使用。
② 灵敏度检查
菌种
• 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥 菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试 验菌株的生物学特性。
• 菌液：浓度<100cfu/ml • 接种：2管+菌液，1管空白 • 结果判断：+菌液----生长良好
空白----无菌生长
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二、无菌检查
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二、无菌检查
2）培养基适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培 养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同 时进行。
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二、无菌检查
2）培养基适用性检查
① 无菌性检查:
• 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶） ，置各培养基规定的温度培 养 14天，应无菌生长。