柱效测定以及影响因素
2m nacl测柱效原理
2m NaCL测柱效原理
3. 染色和测量：在电泳结束后，可以使用染色剂如Coomassie蓝染色来可视化蛋白质在 凝胶上的分离。然后，通过测量蛋白质迁移距离与已知分子量标准品迁移距离之间的关系， 可以推断待测蛋白质的分子量。
需要注意的是，2M NaCl测柱效方法是一种相对分子量测定方法，只能提供待测蛋白质 的大致分子量范围。对于精确的分子量测定，通常需要使用其他方法如质谱分析。此外，不 同蛋白质的迁移行为可能会受到其他因素的影响，如蛋白质的结构、电泳条件等，因此在使 用2M NaCl测柱效方法时需要谨慎解2M NaCl测柱效（也称为2M NaCl测定效）是一种用于测定蛋白质分子量的方法，基于 蛋白质在2M NaCl溶液中的迁移行为。其原理如下：
1. 蛋白质迁移：将待测蛋白质样品加入2M NaCl溶液中，并加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）凝胶槽中。在电泳过程中，蛋白质会受到电场的作用，向电极方向迁移。
柱效测定以及影响因素
柱效测定以及影响因素柱效测定（Column Efficiency Determination）是指在色谱分析中通过柱沉淀试剂的稳定迁移时间与溶质峰宽的比值来评估柱效的一种方法。
柱效是指柱对样品的分离能力，它取决于柱填充剂的形状和物理化学性质，以及流体力学特性和柱床操作参数等一系列因素。
柱效测定可以帮助分析人员评估柱的性能，并确定最佳的柱操作参数，以提高分离效果和增强分析结果的准确性。
影响柱效的因素较多，下面将对其中几个关键因素进行详细说明。
1.柱填充剂：柱的填充剂是决定柱效的关键因素之一、填充剂的表面性质、孔径大小、孔隙度以及孔道分布等特性都会对柱效产生影响。
孔径大小直接影响柱的分离能力，较小的孔径可提供更大的表面积，并且具有更好的分离效果。
孔隙度和孔道分布则决定了样品分子在柱中的扩散速度和传质能力。
因此，选择合适的填充剂是提高柱效的重要步骤。
2.面层润湿性：表面润湿性是表征柱填充剂孔道分布均匀性和表面润湿程度的重要指标。
不同样品的表面润湿性不同，一些样品在柱填充剂的表面上难以均匀分布，导致部分样品分子的扩散速度较快，使得分离能力降低。
因此，在选择填充剂时，要根据不同的液相样品，选择适合的表面润湿性，以提高柱效。
3.柱长度和内径：柱的长度和内径是影响柱效的重要参数之一、柱长度的选择与待分离的成分数目和分离程度有关，理论上，柱越长，分离程度越高。
然而，随着柱长度的增加，分析时间也会增加。
柱内径越小，柱效越高，但是流速也会减小，分析时间会延长。
因此，在实际应用中，需要根据分析要求平衡分离效果和分析时间，选择合适的柱长度和内径。
4.流速和温度：流速和温度是影响柱效的重要操作参数。
流速的选择需要平衡分离效果和分析时间。
流速过高可能会导致溶质在柱中的分离不完全，流速过低则分析时间会较长。
温度的选择与柱的填充剂和待分离的样品有关。
温度的升高可以提高溶质的扩散速度和减小粘度，有利于更好的分离效果。
但同时，温度过高也可能会引起溶解度的变化和柱填充剂的损失，影响柱效。
GE中低压层析柱-柱效测定方法-详解
GE中低压层析柱柱效测定方法柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。
只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液： 0.4 M NaCl水溶液样品： 0.8 M NaCl水溶液3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。
大家测柱效的结果只有一个峰）1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件，在Curve窗格中点击右键，选择Customize2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线3)在工具栏中点击峰积分按钮，进行积分处理或者在Integrate下拉菜单中点击Peak Intergrate进行积分处理4) 选择需要积分的曲线以及积分表存储位置，基线类型默认为Calculatebaseline5) 在积分窗口中点击Peak Window，出现以下窗口，通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围，点击OK确认6) 在积分窗口点击Reject Peaks对需要分析的色谱峰可进行高级定义，包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等，在这里最常用的是在Peakarea is less than输入需要显示的最大峰的个数，点击OK确定7) 在Column height (bed height)一栏中输入柱床高度，在柱效测定中此项必须填写8) 点击积分窗口中Save and Edit Peak Table按钮，可以对峰进行高级操作9) 点击积分窗口中的OK，查看积分结果10) 在Peak data区域点击右键，选择Customize 在Select peak table columns对话框中找到需要显示的数据， plate height（HETP）、Asymmetry 等，点击OK执行。
层析柱效测定方法
层析柱效测定方法层析柱效测定方法（chromatographic column efficiency determination）是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
它是基于层析柱内物质的扩散和传质过程进行分析的。
层析柱是一种分离技术装置，由一系列填充物组成。
填充物通常是固体颗粒，具有特定的化学性质，用于分离混合物中的组分。
在层析柱内，混合物通过与填充物的相互作用，使组分分离出来。
层析柱效测定方法通过评估层析柱中物质的传质速率和峰形状，来判断层析柱的性能。
这种方法可以用于评估柱的分离效果、分离能力、分离度等指标，为柱的选择和优化提供依据。
层析柱效测定方法通常基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析。
在柱内，混合物在填充物表面发生吸附，不同组分的吸附速率不同，导致分离。
通过测定柱内物质的扩散速率，可以评估层析柱的分离效果。
层析柱效测定方法可以通过测定柱内物质的保留时间、峰宽、峰高等参数进行分析。
保留时间是指物质从进样口进入柱内到出柱的时间，峰宽是指峰的宽度，峰高是指峰的高度。
这些参数可以通过实验测定，然后根据相关理论模型进行计算和分析。
层析柱效测定方法有多种实验方法和理论模型可供选择。
常用的方法包括质量平衡法、色谱法、逆向色谱法等。
这些方法在实验操作上有所差异，但都可以用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用。
它可以用于分析混合物中的组分，研究物质的分离和纯化，以及评估柱的性能。
同时，层析柱效测定方法还可以用于优化柱的选择和操作条件，提高分离效果和分离能力。
层析柱效测定方法是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
它基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析，通过测定保留时间、峰宽、峰高等参数来评估柱的性能。
层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用，为分析、研究和优化提供了重要手段。
色谱柱表征
色谱柱表征
色谱柱是色谱分离实验中的关键部分，它的性能直接影响到实验的结果。
色谱柱的表征主要包括以下几个方面：
1.柱效：柱效是指色谱柱对分离对象的分离能力，通常用分离度（分离系数或α值来表示）。
柱效受到柱材料、柱填料的粒度、柱的均匀性等因素的影响。
2.柱容量：柱容量是指柱子能够容纳的样品量，与柱填料的比表面积、柱的长度、柱的直径等因素有关。
3.柱寿命：柱寿命是指柱子在使用过程中，柱效保持稳定的时间。
柱寿命受到柱材料、柱填料、柱的工作条件等因素的影响。
4.柱压降：柱压降是指在色谱分离过程中，柱子产生的阻力，使载气压降。
柱压降受到柱长度、柱填料的粒度、柱的工作条件等因素的影响。
5.柱温：是指色谱柱的工作温度。
柱温对柱效、柱容量、柱寿命等性能指标都有影响，同时也影响到分离对象的挥发度、热稳定性等因素。
6.柱稳定性：柱稳定性是指柱子在重复使用过程中，柱效、柱容量等性能指标的变化程度。
柱稳定性受到柱材料、柱填料、柱的工作条件等因素的影响。
综上所述，色谱柱的表征主要包括柱效、柱容量、柱寿命、柱压降、柱温和柱稳定性等方面，这些因素共同决定了柱子的分离效
果和使用性能。
在实际操作中，需要根据实验目的和样品特性，选择合适的色谱柱，以达到最佳的分离效果。
色谱柱柱效
色谱柱柱效关于“色谱柱柱效”色谱柱是色谱分析中的核心部件，其质量的好坏对于分析结果具有重要的影响。
色谱柱柱效是衡量色谱柱品质好坏的重要指标。
本文将对色谱柱柱效进行详细介绍。
一、什么是色谱柱柱效？色谱柱柱效是用于描述色谱柱分离性能的一个指标，用来反映某一物质在色谱柱中距离占总色谱柱长度的百分数，即某一物质在色谱柱中的保留时间。
通俗地说，色谱柱柱效就是描述色谱柱在分离上表现的能力或强度的量化指标。
色谱柱柱效的高低取决于柱内填料的特性和柱的设计。
它与分离石英管的长度和直径、填料颗粒大小、填料类型、填充密度等有关。
二、色谱柱柱效的计算方法在分析中，某一物质在色谱柱中的保留时间（tR）除以色谱柱的总长度（L）即可得出该物质在色谱柱中占据的百分比，即柱效（N）。
柱效（N）=保留时间（tR）/ 总柱长（L）×100%其中，保留时间的计算方法是在一定的条件下，测量该物质的到达时间（ta）和流出时间（tf）后，减去流出时间，即tR=tf – ta。
三、如何影响色谱柱柱效？总的来说，影响色谱柱柱效的因素主要有以下几点：1、填料类型锥形管填充材料是影响柱效的重要因素之一。
柱效随填料活性的增加而增加。
2、填料粒径填料粒径可以影响柱效。
通常情况下，细小的颗粒（即小粒径）的柱比粗颗粒（大粒径）的柱效果更好。
3、填料形状填料形状也会影响色谱柱柱效。
颗粒形状越规则，柱效越高。
4、柱直径随着柱直径的不断增加，柱效不断降低。
5、流速在某些情况下，流速的增加可能会提高柱效。
但随着流速的继续增加，柱效会逐渐降低。
四、如何提高色谱柱柱效？了解了色谱柱柱效的影响因素后，提高色谱柱柱效的方法也就很清晰。
1、选择合适的填料和填料粒径，根据分析需要进行选择，最大化柱效的作用。
2、保持柱内工作温度的稳定。
在色谱柱用于样品分离过程的过程中，温度波动会导致柱效下降。
3、注意选择适当的流量。
流量过大或过小都会影响柱效。
4、柱的维护保养。
柱就像人的身体一样，需要保持良好的状态才能发挥出良好的性能。
影响氢焰检测器灵敏度的几个主要因素、氢焰检测器敏感度的测定、色谱柱的柱效的测定
定量剖析实验三影响氢焰检测器敏捷度的几个主要要素、氢焰检测器敏感度的测定、色谱柱的柱效的测定【目的要求】认识氢气流量、空气流量、载气流量等操作条件对氢焰检测器敏感度的影响。
学会测氢焰检测器的敏感度。
【基来源理】【实验条件】气相色谱仪色谱柱SE-305%不锈钢柱，长2m，内径3mm载气N2，流量：50mL/min检测器FID柱温70℃进样口（汽化室）、检测器温度150℃样品：正庚烷、苯、正戊醇，甲醇为溶剂【操作步骤】1．开机①开电源，开载气，调氮气流量到50mL/min，调柱温到70℃，调进样口、检测器温度到150℃。
②按“升温”按钮开始升温。
③调空气流量到500mL/min，氢气流量到75mL/min以上，按“点火”按钮，假如点火成功，会听到一声洪亮的爆鸣声，并会看到点火成功的提示（氢气的点火流量应大于最正确工作流量，不然火点不燃，假如空气流量太小，则火也点不燃，则听不到爆鸣声，需从头点火）。
④当柱温及进样口温度达到设定温度后，“Ready”显示亮。
待基线基本稳固后，请按“调零”按钮，将目前的基线电压调到零点。
2．氢气氮气流量比对敏捷度的影响这里氮气流量固定到到 50mL/min，改变氢气流量就改变了氢氮流量比。
①选择样品为正庚烷,浓度为10mg/L,进样量为1mL,范围为1(101),记录敏捷度为8mv/满刻度。
②将氢气流量分别调到15、30、40、50、60、70mL/min（氢气流量不可以太小，太小了会熄火），分别进样，进样的同时按“开始记录”按钮，记录色谱图，色谱峰流出完后，按“停止记录”按钮，计算时机在屏幕上打印出组分的保存时间和峰面积，注意氢气流量的改变对氢焰检测器的敏捷度的影响，将结果输进下表。
氢气流量(ml/min) 15 30 40 50 60 70氮氢流量比10:35:35:41:15:65:7空气氢气流量比4:58:516:532:58:110 :112: 1依据最正确条件的剖析结果，按公式S·A·range/m计算氢焰检m 测器的敏捷度（正庚烷的比重）。
常用液相色谱柱的柱效测定方法应趋于统一化
参 考 文 献
［ １］ ＨＡ Ｐ Ｐ Ｃ Ｅ Ｓ Ｒ Ｏ Ｋ Ｔ Ｃ ＯＭＰ Ｅ ＵＴ Ｒ ＭＯ－ ＤＥ Ｐ －５０ Ｓ Ｒ Ｔ Ｏ ＭＡ ＡＬ Ｌ Ｃ １０ Ｉ Ｔ ＵＣ Ｉ Ｎ ＮＵ ． Ｎ
［ ］ Ｃ —１５ ２ Ｐ —！ ００湔浼扑慊 褂檬植 幔 本┘扑
五厂。
［ ］ ３ 计算机基础 教程， 清华大学出版社。 （ 收稿日 期：１８年１月 ８ ） ９４ １ 日
应该 大致相同 。
建议流速为１ 分左右；温度采用室温；半峰宽 毫升／
应为半峰宽处峰的一边的外侧到另一边的内侧，测 量工具应精确到０ １ ． 毫米。 ． 或０ ２ ０ ０ 不难看出，影响柱效测定的因素是很多的。测 定的方法不同，测得的柱效肯定不同，所以测得的 柱效应附有上述的所有实验条件，否则只说某一填 料和某一预装柱的柱效达到多少实在是笼统的很。 所以如果生产填料的厂家，使用单位和装柱单位对 同一填料的色 谱性能有争议的话，最好看一下填料 的批号是否一致，然后再看一下柱效的测定方法和 测试条件是否一致 （ 大体）。所以最好的办法还是 价在大体相同的条件下测定柱效，这样对填料的评 就有了共同的语言，使厂家找到了要质量控制的依 据，用户了解到了填料的性能，以便更好地选用。 （ 公安部１２研究所 李冶） １９
常用液相色谱柱的柱效测定方法应趋于统一化
柱效的高低，不仅反映出填料性能，有时也反 映出装填技术的好坏。所以测定柱效无论对于生产 填料或预装柱的厂家，还是对于使用填料或预装柱 的色谱工作者来说，都是很重要的。 厂家通过柱效测定，达到对填料生产的质量控 制；色谱工作者通过测定柱效，可选择色谱柱并监 察色谱柱使用过程中是否受到污染之目的。可见柱 效的测定很重要。 但是如何进行柱效的测定，是值得研究的一个 问题。不同的色谱柱，柱效固然不同；就是同一根 色谱柱，由于柱效的测定方法不同，诸如所用的化 合物、流动相、流速、测量温度、测量工具及仪器 等等的不同，那么所得到的理论板数也不尽相同。 这样往往对同一种填料或同一根柱子的评价就缺乏 共同语言，往往使填料的生产厂家、用户及装柱单 位之间产生误解，有碍协作。 因此柱效的测定方法应趋于统一化，测定条件
高效液相色谱柱效能的测定
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 灵敏度高； 10-9g·mL-1 线性范围宽； 对流动相的流速和温度 变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱效能的测定
一、实验目的： 1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法。 2.了解高效液相色谱仪的基本结构及工作原理。 3.初步掌握高效液相色谱仪的操作及使用。
应的流动相并过滤脱气。 二、开 机 1.依次打开2130高压泵、检测器和计算机电源开关，
设定合适的检测波长。 2.双击桌面上的T2000P色谱工作站图标，进入工作站
系统。
三、编辑HPLC分析方法 1.双击“方法”图标，编辑HPLC分析方法。 2. 保存所编辑的HPLC分析方法。 四、样品分析与采集数据 1.在文件栏中选择分析方法文件。 2.手动进样: 在方法栏中依提示输入文件名称、样品
己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、水为二次蒸馏 水
四、实验条件：
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
2、主要部件
（1）、进样装置
使用高压定量进样阀(六通阀)进样装进样体积 由定量管控制，进样准确，重现性好，适于定量 分析。
气相色谱定性和色谱柱效的测定
实验五 气相色谱定性和色谱柱效的测定一、目的要求1．了解气相色谱仪的基本结构，热导池检测器（TCD ）工作原理及操作技术； 2．认知组分的保留时间、保留体积；3．计算相对保留值、色谱柱的理论塔板数、有效理论塔板数及相邻组分的分离度。
二、实验原理1．色谱法是一种重要的分离分析技术混合物→分离→单组分→检测→定性分析→定量分析 气相色谱：是流动相为气体的色谱。
适于分离分析的对象是气体或容易气化的热稳定性好的物质。
2．基本概念色谱图，色谱峰，基线，峰高h ，峰宽w ，半峰宽w 1/2保留时间t R —从进样开始到色谱峰出现最大值时所需要的时间。
死时间t M —不被固定相保留的组分（空气）的保留时间。
调整保留时间t t t M R R -='保留体积 V R = t R F 相对保留值tt R R ''2112=γ理论塔板数 )()(2154.51622W t Wt R R n ⨯=⨯=有效理论塔板数 )()(21'54.5'1622W t Wt n RR ⨯=⨯=有效分离度定义：相邻两组分的分离度，等于两组分保留时间之差与峰宽之和一半的比值。
W W t t R R R 21)(212+-=3．热导池检测器（TCD ）结构及工作原理 热导池 热敏元件（钨丝） 惠斯登电桥线路利用被测组分气体与载气的热导系数不同的原理实现检测。
4．色谱定性依据：在一定色谱条件下，每一种物质都有一个确定的保留值和它相对应。
还可以用试样加入纯物质增加峰高法定性。
相对保留值法定性较好。
三、实验条件1．SP-6800A 型气相色谱仪，热导池检测器（TCD ）;2．不锈钢填充柱：1米长，内径3毫米，内装GDX-103 (80～100目)； 3．1微升微量进样器，氢气（钢瓶或氢气发生器），皂膜流量计。
4．试剂：纯净水，无水乙醇，乙酸乙酯，混合试样。
5．仪器条件：载气（H 2）输入压力0.25MPa 柱前压0.06 MPa汽化室（INJ）温度170℃，检测室（AUX）温度170℃，色谱柱室（OVEN）温度160℃，桥电流150mA, 衰减001。
柱效测定
柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。
只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液：0.4 MNaCl水溶液样品：0.8 M NaCl水溶液⑵丙酮测试系统对于亲和、离子交换和凝胶过滤技术的层析柱和填料平衡液：水样品：1%丙酮的水溶液对于反相和疏水层析柱和填料平衡液：20%乙醇样品：1%丙酮溶于20%乙醇3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。
高效液相色谱(HPLC)柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定093858 张亚辉一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。
高效液相色谱柱柱效测定
高效液相色谱柱柱效测定高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察一、实验目的1(了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理2(学习高效液相色谱仪的使用3(学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法4(考察流动相配比对分离情况的影响二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即:22,,tt,,RR,,n,5.54,16 ,,,,YY,,,1/2,式中:t为组分的保留时间 RY为色谱峰的半峰宽度 1/2Y为色谱峰的峰底宽度影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。
三、仪器和试剂1(仪器:Agilent 1200 高效液相色谱仪(紫外检测器)(50μL微量进样器 23(试剂:苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯;纯水为重蒸的去离子水。
配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。
四、实验条件1(色谱柱长15cm，内径 4.6mm，装填5,m的C-18烷基键合固定相2(流动相组成1:甲醇:水(95:5);组成2:甲醇:水(85:15);流量均为0.8ml/min 3(紫外光度检测器波长254nm4(进样量5μL五、实验步骤1(设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。
2(吸取5μL苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。
3(改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。
4(用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
六、数据记录及处理(记录实验条件。
1(1)色谱柱与固定相(2)流动相及其流量、柱前压(3)检测器波长(4)进样量2(分别记录三个组分色谱峰的保留时间t和相应色谱峰的半峰宽Y。
R1/23(分别计算苯、萘、联苯在两种流动相组成条件下的理论塔板数n，并比较流动相组成改变前后色谱分离的差异。
HPLC柱效测定
HPLC柱效测定
以第一主数据为例
n=)2=2=201.881
柱长25cm
H===0.001238
思考题
1、高效液相液相色谱采用3~10微米的固定相有何优点?同时它又给实验带来什么问题?如何克服？
答：这个是从色谱理论H-u曲线推导出来的结果.在100kg压力左右,5微米的柱效最高.但随加工制造技术的提高,更高压力的泵如400kg,也能够大量的普及.而在400kg左右,1-3微米的固定相柱效更高,所以在HPLC的基础上又有UPLC仪器了.
2、紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物,为什么?
答：不是理由有2 ，第一是并不是所有的有机物都有强的特征紫外吸收，只有特定的集团会有这样的情况。
第二是有频率相近的吸收峰的物质很多，不能完全区分开来。
3、若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件色谱柱？
答：色谱柱使用时间长了，柱效会降低，会影响到分离度的，改善方法是更换新的色谱柱。
如果已经是新的色谱柱了，分离度还不好，那可以采用更长一些的色谱柱，也会增加分离度；流动相的调节，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，分离效率会不一样，这要针对要检测的成分具体情况进行分析确定；改变柱温，相同条件下升高柱温，会增大色谱柱的分离能力而提高分离度。
柱效测定以及影响因素
4.检测系统的滞留体积（系统死体积） 外体积（Vext）应尽量保持足够的低。这一体积指的是上游体积（从上样点到柱体之间）和下游体积（从
柱底到检测器）之和。与扩大样品体积的效果类似，不恰当的检测系统设置也会影响所测试的柱效柱效。因此用于
、
检测的管路应尽可能的短，并且内径应最小且不会造成过大压降。 作为一个普遍的经验法则，一个生物过程层析使用的典型层析柱的柱效检测应保证外体积小于柱体积的 5%，
在层析柱中保留时间缩短，根据范德姆特方程中 C 代表的粒内扩散受到限制，导致峰宽增加。值得一提的是图中的
峰的对称性随液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检测方法减小峰的展宽从而影响到对称性。允许标准
h≤ 3 保证了合适液流速度，从而可以得到最佳的理论柱效柱效。颗粒大小（扩散的特征长度）是决定最佳流速的
、
停留时间（停留体积）
折合的塔板高度
h=HETP/d/P
对称性 As
**达到最大峰高的时间（或洗脱体积）所对
应的停留时间（停留体积）。
相对峰宽通常用理论塔板（N），理论塔板 数（HETP）或折合为塔板高度（h）来迚行 描述：
() σ
σ ()
对称因子 As 描述了与理想高斯峰形状的偏 差，通过对 10%峰高处的峰宽迚行计算得到：
柱效测定以及影响因素
柱效（column efficiency ）是色谱柱在色谱分离过程中主要由热力学因素(操作参数)所决 定的分离效能。通常用理论塔板数、有效塔板数、理论塔板高度、有效塔板高度等表示。 柱效 是衡量色谱柱性能的一项主要指标，柱效越高，分离能力越强。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
示踪物质浓度
半峰高峰宽 Wh 时间（洗脱体积 V）
如想获得最佳柱效则需使外体积小于 3%。在测定柱效前最好测定系统外体积。此外，还需要对柱效检测中的保留 体积迚行记录，以便和填充床以及柱本身的标称保留体积迚行比较。若保留体积进大于预期，则提示检测物和层析 介质之间可能存在相互作用，以及柱外检测系统存在滞留体积。当检测设置一经确立，层析柱安装完毕，需要迚行 连续三次检测以确认该方法的可重复性。
气相色谱定性和色谱柱效的测定
农药残留检测
色谱柱效的测定对于检测食品中的 农药残留至关重要，可以提高检测 的灵敏度和准确性，确保食品中农 药残留量在安全范围内。
营养成分分析
在食品安全检测中，色谱柱效的测 定也用于营养成分的分析，如脂肪、 蛋白质和维生素等，以评估食品的 营养价值。
实际应用中气相色谱定性与色谱柱效的结合使用
THANKS
感谢观看
定性分析与色谱柱效的相互影响
定性分析结果影响色谱柱效评估
通过对比不同色谱柱在相同条件下的定性分析结果，可以评估色谱柱效的优劣。
色谱柱效的提高有助于改进定性分析
不断改进色谱柱的填料和制备技术，可以提高色谱柱效，从而改进定性分析的准 确性和可靠性。
提高色谱柱效的方法与技巧
选择合适的固定相
根据待测物的性质选择合 适的固定相，是提高色谱 柱效的关键。
定性分析与色谱柱效的关联
定性分析依赖于色谱柱效
色谱柱效的高低直接影响到定性分析的准确性，因为只有高 效的色谱柱才能确保样品中的各组分得到有效的分离，从而 准确地进行定性分析。
色谱柱效与定性分析的分辨率
分辨率是定性分析的一个重要指标，高效的色谱柱能提高分 辨率，使样品中的组分更好地分离，便于定性分析。
控制操作条件
如温度、流量和进样量等， 这些因素都会影响色谱柱 效，因此需要严格控制。
维护色谱柱
定期清洗和再生色谱柱， 可以保持其高效性能，延 长使用寿命。
04
实际应用与案例分析
气相色谱定性分析在环境监测中的应用
空气质量检测
土壤和沉积物分析
气相色谱定性分析可以用于检测空气 中的有害气体和挥发性有机物，如苯、 甲苯、二甲苯等，以评估空气质量状 况。
质谱定性
色谱小讲堂013-影响液相柱柱效测试结果的因素
色谱小讲堂013-影响液相柱柱效测试结果的因素校测试方法可以根据每根色谱柱附带的测试报告（Performance Report）提供的方法条件进行试验。
通常实际测试结果比色谱柱所附的测试报告结果偏低是正常的。
因为Agilent测试塔板数的HPLC系统是专门设计的，整个系统扩散体积非常小。
如果测试结果与报告中有很大不同，很大可能是由于色谱系统配置以及死体积等因素的影响。
通常需要考虑的因素有以下几方面：1.不同柱外体积的影响柱外体积是指“额外”或“外部”（相对于色谱柱）体积，是系统的一部分，尤其是各LC 部件、色谱柱之间的连接管线体积、进样体积和流通池体积。
下面的例子就显示了柱外体积的影响（图一）。
当使用4.6×30mm短柱时，10µL的柱外体积可以得到良好的分离结果，当加上一段管线形成50µL的柱外体积，色谱峰变宽、分离度降低。
在向系统中添加体积不明的管线时，这种情况经常发生。
添加一段太长的管线，或内径较大的短管时，会使高柱效色谱柱的分离度变差。
图二展示了不同内径的管线对色谱峰展宽的影响。
管线内径越大，样品谱带在管线内发生的扩散也就越大，色谱峰展宽也就越严重。
原则上，系统的最大柱外体积（管线体积、进样体积和检测器体积）不应超过柱体积的10%。
图二2.管线和色谱柱连接的接头是否合适图三您需要使用与色谱柱匹配并连接恰当的管线和接头。
如图三所示，连接不恰当的接头，会造成色谱峰的展宽。
比如，如果密封圈位置不正确，管线从密封圈伸出过长，会使密封圈与色谱柱入口螺纹产生空隙而发生漏夜；管线从密封圈伸出过短，将产生一段死体积，形成混合腔，导致柱外体积增加，使色谱峰展宽。
故一定要使用正确的接头，并保证色谱柱末端接头位置正确。
上篇讲述的在液相柱柱效测试过程中，不同柱外体积以及管线和色谱柱连接的接头是否合适两大因素对结果的影响，接下来，在下篇中会继续分析在测试过程中通常需要考虑的其他因素。
柱效测定
GE Healthcare应用手册 28-9372-07 AA 层析柱柱效检测固定柱床层析是一种多功能的分离技术，常用于生物医药的分离中。
无论是在保证纯化过程的稳定性还是保证最终产物的安全性上，填充柱的制备和质量认证都是极为重要的步骤。
柱效检测在认证和监测装填柱子效果方面具有重要的地位。
即使柱效检测不能作为单一参数对后期的纯度和回收率进行预测，至少在启动纯化工艺前可作为一种快速途径对层析柱和设备性能进行检测。
该项检测还可用于检查不同运作批次之间柱床完整性的改变。
该手册对检测原理进行一个简要的剖析，并对柱效检测的实验检测操作进行简要的描述。
为方便开发出稳定的检测方案，给予了适当的检测条件，并对其中对检测性能有重要影响的参数进行讨论。
理论背景柱效检测是示踪物质流经柱床时的保留时间的分析。
加载于柱子上的典型检测信号通常是脉冲或阶跃信号。
为了在不干扰的情况下对层析柱进行分析，必需对示踪物质和洗脱条件进行选择，以避免化学物质与介质发生相互作用以及干扰液体流动。
脉冲上样法测柱效脉冲功能是检测使用的最为常见的信号类型。
将小体积的示踪物质加入靠近层析柱入口的液流时，这一展宽的脉冲信号在层析柱出口处分析时呈现为色谱图上的谱峰。
典型的脉冲反应和它的评价在图1中给予了总结。
柱效通常被认为包括两个参数：y整个层析柱的峰展宽情况通常用等价数量的理论塔板数进行描述（平衡阶段）y峰对称性通常用峰对称性A s进行描述。
相对峰宽通常用一定数量的理论塔板（N），一个理论塔板的等价高度（HETP）或更常用折合了的塔板高度（h）来进行描述：对称因子A s描述了与理想高斯峰形状的偏差，通过对10%峰高处的峰宽进行计算得到：A s=b/a术语塔板数N平均停留时间* μ1方差* σ2停留时间** t R停留体积** V R半峰高峰宽W h床高L颗粒半径d/P一个理论塔板的等价高度HETP折合的塔板高度h=HETP/d/P对称性A s*从示踪信号整合中衍生出的停留时间分布（RTD）曲线上的第一和第二参量。
凝胶色谱柱的柱效测定
凝胶色谱柱的柱效测定凝胶色谱法是一种基于分子大小分离的色谱技术，通过使用具有不同孔径的凝胶色谱柱，可以分离分子大小不同的物质。
凝胶色谱柱的柱效是衡量其分离效果的重要参数，下面将介绍凝胶色谱柱的柱效测定方法。
分离度分离度是衡量凝胶色谱柱分离效果的重要指标，它表示相邻两个峰之间的分离程度。
分离度通常用两个峰之间的分离距离来表示，分离距离越大，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
峰对称性峰对称性是指每个峰的形状是否对称，对称性越好，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
通过观察峰的形状，可以判断凝胶色谱柱的峰对称性。
峰高和峰面积峰高和峰面积是衡量凝胶色谱柱分离效果的指标之一。
峰高表示每个峰的高度，峰面积表示每个峰所占的面积。
通过测量峰高和峰面积，可以评估凝胶色谱柱的分离效果。
理论塔板数理论塔板数是衡量凝胶色谱柱分离效果的重要指标之一。
它表示凝胶色谱柱对于特定物质的分离能力，理论塔板数越大，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
分离时间分离时间是衡量凝胶色谱柱分离效果的指标之一。
它表示每个峰通过凝胶色谱柱所需的时间，分离时间越短，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
洗脱体积洗脱体积是衡量凝胶色谱柱分离效果的指标之一。
它表示将样品中各组分完全洗脱所需的洗脱液体积，洗脱体积越小，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
分辨率分辨率是衡量凝胶色谱柱分离效果的重要指标之一。
它表示相邻两个峰之间的分离程度与峰宽之比，分辨率越大，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
柱容量柱容量是衡量凝胶色谱柱能够承受的最大样品量的指标之一。
它表示凝胶色谱柱在达到饱和状态前能够承受的最大样品量，柱容量越大，说明凝胶色谱柱的处理能力越强。