DNA重组-载体构建常见问题及解决方法
载体酶切不完全 同源重组空载
载体酶切不完全同源重组空载1. 概述随着生物技术的发展，基因工程领域的研究日益深入。
在基因工程中，载体酶切和同源重组是常用的技术手段。
然而，有时候在实验进行过程中，会出现载体酶切不完全导致同源重组空载的情况。
这种情况不仅影响了实验结果的准确性，还给科研工作者带来了困扰。
研究载体酶切不完全和同源重组空载的原因以及解决方法对于基因工程领域具有重要意义。
2. 载体酶切不完全的原因（1）酶活性差：一些酶在实验条件下的活性可能会受到影响，导致酶切不完全；（2）酶切位点异质性：某些酶切位点的序列可能存在变异，导致酶切不完全；（3）DNA结构：DNA序列的结构也会影响酶切的效果，一些复杂的DNA结构可能会导致酶切不完全。
3. 同源重组空载的原因（1）载体酶切不完全导致的同源重组空载；（2）实验条件的影响：如温度、pH值等因素可能会影响同源重组的效果；（3）DNA序列的特殊性：一些DNA序列的特殊性可能会导致同源重组空载。
4. 解决载体酶切不完全和同源重组空载的方法（1）优化酶切条件：调整实验条件，如酶的活性、PH值、温度等，以提高酶切的效率；（2）使用多种酶联合酶切：有时候使用多种酶联合酶切可能会提高酶切的效率；（3）DNA序列修饰：对DNA序列进行修饰，如合成修改碱基序列，以改善酶切效果；（4）优化同源重组条件：调整同源重组的条件，如温度、时间等，以提高同源重组的效率。
5. 结语载体酶切不完全和同源重组空载是基因工程领域中常见的问题，解决这些问题对于研究工作者来说具有重要意义。
通过分析载体酶切不完全和同源重组空载的原因，以及采取相应的解决方法，可以有效提高基因工程实验的成功率，促进基因工程领域的发展。
希望今后能有更多的研究能够深入探讨这些问题，为基因工程技术的进步做出贡献。
载体酶切不完全和同源重组空载是基因工程领域中常见的问题，而针对这些问题的解决方法也是多种多样的。
以下我们将进一步探讨这些问题的解决方案，并提出一些新的观点来应对这些挑战。
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
DNA测序常见问题分析及解决办法总结PCR类型测序模板注意事项PCR类型测序模板注意事项•总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。
•对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR 产物作克隆后进行测序。
有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。
•经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。
有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。
纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。
•与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR 退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。
•PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。
•纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。
•若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp •各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。
引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：•PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
716-DNA重组常见问题
DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。
NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。
NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。
应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。
不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。
请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。
说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。
载体构建介绍
5.常见问题
选择标记类型和选择 1、选择性标记类型 药物抗性（如Kan，Amp等） 营养依赖性标记（如SC-Leu 等） 2、如何选择 根据所选载体上所带的标记
5.常见问题
Gateway系统引物设计-需要对读码框
这是因为中间载体和终载体上某些编码氨基酸或者抗性 基因同目的片段共用一个起始密码子。
载体构建
戎浩 2015.12
C
ONTENTS
目录
1 2 3 4
载体简介 载体构建
注意事项 常见问题
1.载体简介
目的基因的克隆与鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
生理检测 纯化
载体构建
大肠转化，质粒 提取与鉴定
移栽
分子检测
继代繁殖 农杆菌的转化与活化
外植体制备
筛选
浸
染
共培养
1.1载体
载体（vector） ，能将外源DNA或基因片段携带入 宿主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。
退火温度不合适，设置梯度，选择最适退火温度
2、条带不单一
引物不特异，适当增长引物序列长度；
适当提高退火温度
5.常见问题
载体酶切的问题 1、酶切质粒浓度和纯度要好 2、酶切温度和时间
如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在
用另一个酶切，时间最好过夜切。 3、没有切开 可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是 否好用
5.常见问题
克隆基因的酶切位点及引物问题 1、单酶切 单酶切后进行连接，质粒自连、目的片段自连、目的
片段之间连接、目的片段和载体各种错误连接、目的片段
反向连接等等，尽量不选单酶切 2、保护碱基数目的问题。 在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保 护碱基，这会使得酶切效率大大提高。
载体构建介绍
1.2载体的功能
运送外源基因高效的转入到受体细胞中 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供条件
1.3载体应具备的条件
具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有多种单一的酶切位点 具有合适的选择性标记
2.载体构建（酶切连接）
3.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶 进行目的片段的扩增。（加尾）
3.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
3.5 BP反应
3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取
3.8 LR反应
现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体 DNA也有可能成为载体。
1.2载体的分类
克隆载体
植 物 基 中间载体 因 工 程 卸甲载体 载 体
表达载体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一元表达载体 双元表达载体
1.2载体分类
克隆载体
可携带出入的外源 DNA片段并可转入受体 细胞中大量扩增的DNA 分子。通常含有筛选 标记，在插入外源的 基因的时候不会破坏 载体本身的自我复制 功能。
1.2载体分类
中间载体
1.2载体分类
卸甲载体
野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期TDNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因Onc， 将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为卸甲载 体。
1.2载体分类
双元表达载体
一般植物表达载体 是成套使用的，一套 中有两个，一个是带 有可以供插入外源表 达基因的MCS和筛选 标签的融合蛋白（通 常是GFP，GUS或抗性 基因蛋白）的普通表 达载体。另一个载体 就是双元表达载体。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
DNA提取和常见问题分析及对策
D NA提取和常见问题分析及对策主讲人：**DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。
为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
D N A提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染D N A提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它D N A提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
DNA测序中的一些常见问题和对策
其抗 <+ 抗体属中和抗 $%&’# 和 $%&’! 的共同抗原决定簇， 体， 中和病毒的能力最强， 能与 $%& 的 <+ 抗原特异结合， 结 果改变了病毒的表面结构， 阻断了病毒对宿主细胞的吸附，
［@］ 使病毒失去了感染能力 。本实验所用的 5678% 中既有能
识别 $%& 的 <;、 也有 <+ 抗原的型共同性特异性单克隆抗体， 能识别 $%& 的 <= 的型特异性单克隆抗体， 体外中和试验也 证明其中和效价为 #( 2 #( ， 具有很强的中和病毒的作用
［$， %］ 序， 都存在下列问题 。
点琼脂糖凝胶回收并用专用试剂盒纯化， 注意纯化后要进行 电泳检测。 # 测序信号提前共同终止， 测序反应无法继续进行
［@］ 、 常见原因： 模板 !"# 中有二级结构形成 8"?& 浓度不
当或模板浓度过大， 导致测序反应提前终止。 对策： 一般商售试剂盒中配套试剂很少出现问题， 若为 自制试剂， 可予替换或重新配制， 再重复实验。由于测序反 应要求模板必须为单链， 所以对于二级结构形成导致的测序 反应共同终止， 可以提高模板变性温度使之充分分解为单 链， 或加入甲酰胺使模板变性充分、 彻底。 $ 无正常测序信号 常见原因： 引物设计不当或模板 3A’ 含量过高。 对策： 测序引物通常分为通用引物和特异性引物。前者 是针对不同克隆载体设计的引物， 一般不会存在上述问题。 特异性引物是指与模板特异性且唯一性结合的引物， 设计原 则如下： （$） 引物长度 ! $= .B， 一般 %)%C .B； （ %） 3A’ 含量 ! 一般为 C)D<)D （ ；@） 避免引物自身形成互补； （ E） C)D ， @F 末 端为 3 或 ’ 更为合理。模板 3A’ 含量过高者可采用专门为 高 3A’ 含量模板设计的测序试剂盒。 靠近引物的区域， 其测序信号可能由于引物峰遮盖而无 法阅读， 是 测 序 的 难 点。可 以 尝 试 加 入 /*% G（ $)) HH64 , I
载体构建经验谈 二
载体构建经验谈二做酶切要注意的问题重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下：1) 克隆基因的酶切位点问题2) 载体酶切的问题3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4NdeI 6NheI 3NotI 8PmeI 6SacI 3SalI 3SmaI 3HindIII 3BstI 8SphI 4XhoI 3XbaI 3SmaI 4案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基。
现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
基因工程技术使用中的常见问题及解决方法
基因工程技术使用中的常见问题及解决方法随着科学技术的不断进步，基因工程技术被广泛应用于医学、农业、环境保护等领域，为人类社会的发展带来巨大的潜力和机遇。
然而，与此同时，基因工程技术使用中也会遇到一些常见问题。
本文将对这些问题进行解析，并提供解决方法，以期帮助读者更好地理解和应用基因工程技术。
常见问题一：目标基因无法稳定表达在基因工程技术中，常常需要将外源基因导入到目标生物体中，并使其稳定表达。
然而，由于转基因过程中的多种因素，往往导致目标基因无法稳定表达，表现为低表达或完全不表达。
针对这种情况，可以考虑以下解决方法：1. 优化启动子和终止子：启动子和终止子是控制基因表达的关键序列，合理选择和优化它们，可以提高目标基因的表达水平。
2. 选择适当的载体：合理选择载体的基本元件，如选择具有高转录活性的启动子和转录因子，有助于增加目标基因的表达水平。
3. 考虑信号序列：某些外源基因需要特定信号序列的介导才能正确定位到细胞器或细胞膜上，因此，在设计转基因实验时，应该根据目标基因的特点，加入适当的信号序列。
常见问题二：基因编辑技术中的意外剪切事件基因编辑技术是一种广泛应用的基因工程技术，通过对基因组进行针对性的修饰来实现特定基因的删除、插入或编辑。
然而，由于技术的复杂性，有时会发生意外的剪切事件，导致不完全的或不准确的编辑。
下面是一些常见的问题和解决方法：1. 优化工作流程：合理选择基因编辑酶、优化酶反应条件，如温度、酶浓度和反应时间，以最大限度地减少非特异性剪切。
2. 加强规范实验：正确使用试剂和仪器，遵守实验室操作规程，如低容量多管道操作、持续质量控制，能够减少人为因素对实验结果的影响。
3. 选择适当的细胞系：在进行基因编辑实验时，细胞系的选择也很重要。
合理选择易于编辑的细胞系，可以提高编辑效率和准确性。
常见问题三：基因转导的有效性基因转导是将外源基因转运到目标细胞中的过程。
但是，市面上许多转导方法都存在一些限制，如低效和细胞毒性等问题。
DNA重组实验常见问题分析
DNA重组实验常见问题分析•DNA重组实验常见问题分析载体用NotI单酶切，目的片段也用NotI单酶切，并对载体进行去磷酸化，但一直也没连上？参考见解：1、用NEB的高效连接酶连看看，用400U或2000U的试试2、 16度过夜连接，或更长3、单酶切用PCR来鉴定方向方便些4、去磷酸化后，将去磷酸化酶失活很重要，否则可能根本连不上。
5、失活的方法很多了，可以加热（有的热敏感酶可以），可以直接过胶回收柱子，但比较放心的方法就是跑胶回收。
PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI 和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶切8小时，同时，p UC18 同样酶切，连接片段和载体DNA酶切均用QIAGEN quick spin column回收片段，按NEB 连接酶说明过夜连接，连接产物电转化。
但是，看转化结果，连接产物转化的平板大部分是蓝斑？什么原因？参考见解:1、柱子回收一般没有问题，但会不会存在操作问题，所以回收产物可以跑胶或用紫外分光系统检测一下有没有DNA。
2、PCR产物直接酶切，在设计引物的时候有没有在酶切位点两边加保护碱基？这里pcr产物酶切出问题的可能性很大。
3、酶有没有问题？可以用这两个酶切一些已知的质粒看看能不能得到所要的片断。
4、大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全，也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体，这样不能完全除去酶切掉的小片断（Qiagen的柱子对小片断的回收比较好），后来连接反应中小片断可能又连上了。
5、大部分是蓝斑，那就是还有白色的。
挑了白色的摇了提质粒看看啊，说不定就有阳性的。
6、建议在载体酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化，这样可以彻底防止载体的自身环化。
酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶(用的是Hind3/EcoR1双酶切),多高温度适合啊?参考见解：1、一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。
分子生物学实验的常见问题与解决方案范文
分子生物学实验的常见问题与解决方案范文一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。
向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，对于大于15kb的DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。
如果实验转膜过程中同时含有大于15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断DNA的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。
转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。
2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTriHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。
DNA片段的克隆及常见的问题
北京天为时代科技有限公司
内
容
第一部分：DNA 片段的克隆 第二部分：常见问题及解答
DNA 克隆的目的
目的基因的序列测定及筛选 入门的载体用于基因表达
连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）
TA克隆
是目前广泛使用的一种借用中间载体的非定向克隆方法。由于 普通Taq酶扩增得到的PCR产物带有A末端，可以用带有T末端突 出的T载体直接连接。这个方法比较简便，不需要经过双酶切， 对引物设计也没有要求。
酶切连接克隆
PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切 后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克 隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难， 另外酶切连接过程本身也相当的费时费力。
TA克隆的流程
I.高纯度的基因资源 II.杂交筛选或PCR扩增目的基因
III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、转化 V.目的基因的筛选及鉴定
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对 策
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常见问题分析
问题三：实验组只有白色菌落（没有蓝色菌落）
原因
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未加IPTG/X-Gal或 其失效 抗生素失活，敏感 菌亦能生长 用于制备感受态的 菌株退化，丢失了 某些重要因子
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对 策
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检查平板是否含有 IPTG/X-Gal 以及是否 新鲜,如平板有问题， 重新制备新鲜平板 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌 株，传代次数不能太 多（20代以内为佳）
DNA克隆的操作
转化 连接液的体积 复苏 涂布 (IPTG 及 X-gal ) 培养的温度及时间
DNA合成常见问题解答
精心整理DNA合成常见问题解答1．DNA合成粗产物中含有什么杂质？DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。
需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。
2．如何进行合成产物的纯化？目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种：A)C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以B)OPC基上的力强，TCA 脱去吸附C)HPLC回收主40D)PAGE凝胶，DNA。
环节。
量大、度和长度来增加负载量和分离效果等等。
所以我们一直使用PAGE纯化方式保证合成产物的纯度。
为了保障您的后续实验，请您选用PAGE纯化的产品，特别是现在DNA合成不同纯化方式的价格相差不多的情况下。
3．如何测定引物的OD值？用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。
请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。
举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为0.25，说明该50微升中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
4．如何检测引物的纯度？实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
T载体构建及其构建过程中常见问题的处理方法
T载体构建及其构建过程中常见问题的处理方法*郑高阳,刘晓颖,王振英(天津师范大学化学与生命科学学院天津市细胞遗传与分子调控重点实验室,天津300387)摘 要:PCR产物与克隆载体连接是基因克隆环节中重要的一步。
但是,商品化的T载体价格相对来说比较昂贵。
因此,利用实验中剩余的空载体构建T载体,通过对其连接效率进行验证,证明该方法是一种经济有效的办法,可以满足基因克隆的需要。
关键词:载体构建;转化效率;蓝白斑筛选中图分类号:Q338 文献标识码:B 文章编号:1672-4305(2009)01-0116-02Construction of T-vectors and the m ethods of frequentquesti ons of processi n gZ HENG Gao-yang,LIU X iao-y i n g,WANG Zhen-y ing(T ian jin K ey Lab o f Cy to-genetical and M o lecular Regulati o n,College of Che m istry and Life Sc i ence,T ian jin N or m a lU niversity,T ian ji n300387,Ch i n a)A bstract:The li n kage of PCR product and c l o ning vector is an i m portant step in the process o f a gene clon i n g.But the price o f co mm erc i a lized T-vector is qu ite expensi v e.Therefore,the re m a i n i n g e m pty vector in the experi m ent is used for constructi o n ofT-vector,the efficiency of its connections to verify that the m e t h od is a cost-effective approach to m eet the needs of gene clon i n g.K ey words:constr uction o f vector;conversi o n effic iency;b l u e-w hite spot screen i n g基因克隆是分子生物实验的基本技术之一,即将一段需要克隆的外源DNA片段插入到载体DNA 分子中形成重组DNA分子,然后将该重组载体转运到宿主细胞中,随着宿主细胞的繁殖载体进行复制[1],在这一系列过程中与载体相连的外源基因片段同时被克隆。
DNA重组-载体构建常见问题及解决方法
DNA重组-载体构建常见问题及解决方法载体构建中常见问题及解决方法重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。
所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)目的片段的扩增3) 载体酶切的问题4) 连接片段浓度比的问题5）菌液的提取6）酶切鉴定7）表达鉴定一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。
参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。
注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基二目的片段的扩增目的片段扩增失败的原因和可采取措施：1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。
三载体酶切的问题酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：1）酶切质粒浓度和纯度要好2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切四连接片段浓度比的问题1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。
载体构建技术经验分享
载体构建技术经验分享一、PCR 过程中的经验教训做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片段较长的时候更是如此。
这样才能在 PCR 过程中减少错配情况。
高保真酶常常对退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火温度是 Tm 值+3 度。
PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。
我就曾经用普通的酶进行过PCR，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配，而且每次都不一样。
二、PCR 产物直接酶切后连接不成功当你获得 PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。
但往往会出现连接不成功的，原因以 PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。
因为这个时候 PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就赶紧做个 T-A 克隆吧三、T-A 克隆应注意的问题T-A 克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题要注意的。
T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。
但要注意，首先是T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的T 载体，这样会切成多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。
其次，因为在 PCR 产物是用高保真酶扩增的，所以首先要进行加 A 反应。
这时候应购买 T-A 快速克隆平末端加A 试剂盒。
进行加A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。
我开始就是这样，想着节约，说明书写的是PCR 产物加15ul,我没舍得，加了3ul,加A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。
后来我 PCR 产物加为 6ul,就成功了，屡试不爽。
基因工程技术的实验问题解答与解决思路
基因工程技术的实验问题解答与解决思路基因工程技术广泛应用于生物学研究、医学治疗和农业生产等领域，但在实验过程中常常面临一系列问题。
本文将针对基因工程实验中常见问题进行解答，并提供解决思路，以帮助科研人员更好地开展实验。
1. 如何选择适合的载体？载体在基因工程实验中承载与转导目标基因的重要作用。
选择合适的载体需要考虑载体的大小、拷贝数和稳定性等因素。
常用的载体包括质粒和病毒。
选择质粒载体时，可以考虑载体的拷贝数较高、易提取和方便操作等优点；选择病毒载体时，可以考虑其高效率的转导能力。
根据实验需求，综合考虑以上因素，选择适合的载体。
2. 如何确保基因插入的准确性？在基因工程实验中，准确地插入目标基因是关键。
常用的方法包括限制性内切酶切割、PCR扩增和基因克隆等。
限制性内切酶切割通过特异酶切割目标DNA和载体DNA，然后将其黏合，使目标基因被准确地插入载体。
PCR扩增可以通过合成引物和反应条件的控制，将目标基因准确扩增。
基因克隆技术则通过DNA重组酶和适当调节操作条件，将目标基因高效地插入载体。
在实验中需严格控制反应条件，检验插入产物是否准确。
3. 如何解决基因表达低的问题？基因表达低是常见的实验问题。
可以采取以下措施提高基因表达水平：优化启动子和转录起始位点的选择以增强转录效率；调整培养条件，如调节温度和培养基成分等，以影响蛋白质合成速率；引入增强子或增强子序列，以增加基因的表达水平；使用合适的宿主系统，如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等，根据不同基因的特性选择合适的宿主。
4. 如何解决基因编辑中的误操作？基因编辑是一项复杂的技术，误操作常常会导致实验失败或产生不准确的结果。
为了避免误操作，首先应详细阅读实验操作手册，了解每个步骤的详细操作要求，并明确实验目标。
另外，严格控制实验条件和实验步骤，如温度、时间和试剂使用等。
在实验过程中，可以进行实时监测和验证，确保操作的准确性。
同时，实验操作前应进行充分的练习和训练，提高操作的熟练度，减少误操作的可能性。
遗传工程中重组载体的构建及稳定性问题
·64·工 作 研 究农业开发与装备 2015年第10期摘要：遗传工程，又称基因工程，其最终目的就是获得可以工业化生产的下游产品或外源基因稳定表达的产物，而重组质粒作为基因工程中的核心步骤，其稳定性对基因工程产物的生产也至关重要。
本文简要阐述了几种常用的重组质粒的构建方法，并就其稳定性在遗传工程中的重要性、提高稳定性措施等几个方面作一简要介绍。
关键词：重组质粒；不稳定性；原因；措施1 重组载体构建的方法1.1 传统的载体构建方法质粒载体DNA在体外经限制性内切酶酶切，然后在DNA连接酶的作用下同目的基因结合成环，最终得到转化载体。
为了与合适的启动子、选择性标记基因等序列元件连接，中间还需要转换多个载体和一系列的酶切、连接、转化、回收等工作，因此，传统的载体构建方法路线设计和实际操作往往比较麻烦，通常需要构建多个中间载体，费时费力。
但是，采用传统的构建方法还是一种比较安全、稳妥的选择，而且能够获得预期的结果。
1.2 Gateway技术Gateway是Invitrogen公司开发的一项基因克隆和表达的新技术，它利用位点特异重组构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，而且一旦拥有了一个入门载体，就可以利用它将目标基因多次转移到各种不同的表达载体上。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不会影响不同基因的测序结果，因而每当使用一种新的表达系统时，可以节省大量时间。
1.3 含三段T-DNA载体由于目标基因和选择标记基因位于不同载体或不同T-DNA 上，后代中能够获得无标记转基因植株，获得频率同样比较低。
叶兴国等研究构建了包含三段T-DNA的双元表达载体，其中的一段T-DNA区域含标记基因，另外二段T-DNA区域含目标基因，用其转化大豆后较高频率获得了无标记转基因植株。
1.4 一步克隆法是一种多片段拼接的单交换表达载体，是一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法，它适合构建大小为6 kb以下的载体。
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载体构建中常见问题及解决方法
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。
所涉及内容如下：
1)克隆基因的酶切位点问题
2)目的片段的扩增
3) 载体酶切的问题
4) 连接片段浓度比的问题
5）菌液的提取
6）酶切鉴定
7）表达鉴定
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。
参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。
注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基
二目的片段的扩增
目的片段扩增失败的原因和可采取措施：
1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；
2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；
3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。
三载体酶切的问题
酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：
1）酶切质粒浓度和纯度要好
2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切
四连接片段浓度比的问题
1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；
2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；
3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。
五菌液的提取及菌落PCR
挑菌时选择个头较大的单克隆，摇菌培养时间不宜过长。
为了方便发现问题，菌落PCR要设置阳性对照组（原始目的片段做模板）和阴性对照组（以双蒸水为模板）。
出现的问题和可采取措施：
1）多次PCR均无阳性克隆存在：假阳性过高，可能是由于抗性失效，建议换培养皿；
2）阴性对照组也有条带：可能是因为引物或其他试剂被模板污染了，建议所有试剂全部换掉；
3）阳性对照也无条带：酶失活或者其它试剂发生问题或忘记添加，重
新换试剂PCR鉴定
鉴定为阳性的克隆记得保存原菌液，避免后续转化过程发生突变而丢失连接成功的克隆。
六酶切鉴定
菌落PCR阳性的质粒，提取后不一定能够酶切鉴定成功，针对可能存在的问题介绍一下相应的改善措施
1）质粒浓度尽量高点，如果提出的质粒浓度较低，建议重新转化到高拷贝的细菌中，再重新提质粒进行酶切鉴定（如BL21属于低拷贝菌，DH-5α和JM109属于高拷贝菌）
2）没有切开：可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是否好用。
七表达鉴定
有的克隆前面的步骤都正确，可就是不表达：
1）有的载体质粒为单顺反子，且启动子位于多克隆位点之后，这种情况要求在扩增目的片段是引物要含有起始密码子，否则是无法表达出相应蛋白的。
2）注意表达细胞系的状态及转染效率，转染效率可以用带荧光标签的载体进行检测。
当然，最后一定要送测序，确定完全无误后方可进行后续的实验研究。
如果是研究蛋白功能，当测序结果不是100%的时候，检查差异的碱基是不是同义突变，如果是，也不影响后续实验的。
如：UCU,UCC,UCA,UCG均编码丝氨酸。