DNA重组-载体构建常见问题及解决方法

载体构建中常见问题及解决方法
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。

所涉及内容如下：
1)克隆基因的酶切位点问题
2)目的片段的扩增
3) 载体酶切的问题
4) 连接片段浓度比的问题
5）菌液的提取
6）酶切鉴定
7）表达鉴定
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。

参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。

注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。

2．切割率：正确识别并酶切的效率
3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基
二目的片段的扩增
目的片段扩增失败的原因和可采取措施：
1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；
2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；
3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。

三载体酶切的问题
酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：
1）酶切质粒浓度和纯度要好
2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切
四连接片段浓度比的问题
1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；
2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；
3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。

五菌液的提取及菌落PCR
挑菌时选择个头较大的单克隆，摇菌培养时间不宜过长。

为了方便发现问题，菌落PCR要设置阳性对照组（原始目的片段做模板）和阴性对照组（以双蒸水为模板）。

出现的问题和可采取措施：
1）多次PCR均无阳性克隆存在：假阳性过高，可能是由于抗性失效，建议换培养皿；
2）阴性对照组也有条带：可能是因为引物或其他试剂被模板污染了，建议所有试剂全部换掉；
3）阳性对照也无条带：酶失活或者其它试剂发生问题或忘记添加，重
新换试剂PCR鉴定
鉴定为阳性的克隆记得保存原菌液，避免后续转化过程发生突变而丢失连接成功的克隆。

六酶切鉴定
菌落PCR阳性的质粒，提取后不一定能够酶切鉴定成功，针对可能存在的问题介绍一下相应的改善措施
1）质粒浓度尽量高点，如果提出的质粒浓度较低，建议重新转化到高拷贝的细菌中，再重新提质粒进行酶切鉴定（如BL21属于低拷贝菌，DH-5α和JM109属于高拷贝菌）
2）没有切开：可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是否好用。

七表达鉴定
有的克隆前面的步骤都正确，可就是不表达：
1）有的载体质粒为单顺反子，且启动子位于多克隆位点之后，这种情况要求在扩增目的片段是引物要含有起始密码子，否则是无法表达出相应蛋白的。

2）注意表达细胞系的状态及转染效率，转染效率可以用带荧光标签的载体进行检测。

当然，最后一定要送测序，确定完全无误后方可进行后续的实验研究。

如果是研究蛋白功能，当测序结果不是100%的时候，检查差异的碱基是不是同义突变，如果是，也不影响后续实验的。

如：UCU,UCC,UCA,UCG均编码丝氨酸。