综合性实验三、抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定

西安医学院教案

（专业课程）

课程名称临床免疫学

与检验

班级检本1008 专业，层次检验，本科

教师武永红专业技

术职务

讲师

授课方式

（大，小班，

实习）

实验学时9学时

授课题目（章，节）抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定

基本教材或主要参考书王兰兰，许化溪主编.临床免疫学检验.第5版：人民卫生出版社，2012 刘辉．临床免疫学与检验实验指导第3版：人民卫生出版社，2009 曹励民．免疫学检验实验指导．自编教材，2011

教学目的：

1.掌握：细菌接种培养的操作能力，加强细菌性抗原免疫动物的实验操作能力，肥达氏反应的模拟操作及间接血凝实验测定细菌性抗体的效价，

2.熟悉：临床用于诊断细菌或病毒感染的凝集反应测定效价试验的原理。

教学内容：

1.细菌培养与免疫原的制备

2.“O”和抗“H”血清的制备

3.试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价

4.间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价

教学方法：启发式教学；讲授重点内容。

教具：板书示教

教学重点、难点：

1. 间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价

教研室审阅意见

（教研室主任签名）

年月日

教学内容教学手段

时间分配

抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定

（一）细菌培养与免疫原的制备

（二）“O”和抗“H”血清的制备

（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价

（四）间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价

（一）细菌培养与免疫原的制备

伤寒沙门菌标准菌株干粉→生理盐水溶解→接种肉汤培养基→接种普通平板→生理盐水菌液（100℃水浴制备O抗原，甲醛处理制备H抗原）

（二）“O”和抗“H”血清的制备

Ag伤寒沙门菌O和H抗原→分别免疫两组家兔→抗O血清和抗H血清

O/H抗原的免疫程序：

日序（天）免疫剂量（ml）免疫途径

1 1 皮内五点注射

8 1.5 耳静脉注射

15 1.5 耳静脉注射

22 1.5 耳静脉注射

放血方法：颈动脉采血

试血方法：试管凝集试验

（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价

试管凝集试验的原理：在试管内，用已知颗粒性抗原作为诊断试剂，与一系列倍比稀释的待检血清混合反应，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象。步骤和方法：

1．试管编号标记。

2．试管凝集操作程序（单位：ml）

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9（对照）

生理盐水0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1：10血清0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃

0.5 诊断菌液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 终稀释度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 -＃讲解

20分

学生操作160分

讲解

20分

学生操作160分

摇匀置37℃2~4h，取出置室温过夜后观察结果。

结果和评价

判断凝集试验结果，要有良好的光源和黑暗的背景，先不振摇，观察试管底部凝集物和上清的浊度。然后轻轻摇动试管，逐一观察凝集颗粒的松软度、大小、均匀度等性状及液体的混浊程度。

1．先观察盐水对照管凝集现象，轻轻摇动试管，细菌分散均匀混浊。

2．伤寒沙门菌O抗原凝集物呈颗粒状沉于管底，轻摇时不易散开（H抗原凝集物呈絮状，疏松而大块地沉于管底，轻摇易离散）。凝集程度通常以“+”表示强弱。

“4+”很强，细菌全部凝集，凝块全沉于管底，液体澄清，凝块全沉于管底。。“3+”强，细菌大部分凝集，液体稍混浊。

“2+”中等强度，细菌约50%凝集沉于管底，液体较混浊。

“+”弱，仅少量细菌凝集，液体混浊。

“—”不凝集，液体混浊度与对照管相同。

3．只要待测血清管出现“2+”以上的反应现象，就可判断为阳性；以出现“2+”凝集的最大血清稀释度为待检血清的抗体效价。

4．本试验是一经典的定量凝集试验，敏感性不高，但操作方法简单，至今仍在使用。

注意事项

1．试管凝集试验只有在抗原抗体比例适当时才能出现肉眼可见的反应，一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反无凝集现象出现，此为前带反应现象。出现该情况时，需加大抗体稀释度重新试验。

2．注意温度、电解质、振摇对实验结果的影响。抗原抗体加入后，要充分混匀，以增加抗原抗体的接触。

临床意义、方法评价：

外斐反应——斑疹伤寒立克次体

肥达试验——诊断伤寒、副伤寒

交叉配血

既能定性又能半定量，但特异性、敏感性不高。

（四）间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价

原理:

将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关、大小均匀的载体颗粒表面，再与相应抗体在适宜条件下相互作用，可发生抗原抗体反应而使颗粒被动的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，这种方法称间接凝集试验。如将抗体吸附于颗粒表面用以检测抗原，则称为反向间接凝集试验，方法和原理与前者相同。实验室常用的载体有红细胞、胶乳颗粒等。以红细胞为载体颗粒的间接凝集试验称为间接血凝试验。‘

‘

讲解

20分

学生操作160分

技术要点：

1．致敏SRBC的制备取2%SRBC悬液（1滴压积SRBC+2ml生理盐水）与等量1：10伤寒沙门菌O（H）菌液混合，置37℃水浴2小时，其间应该每隔15分钟摇动一次，取出后离心，弃上清液，用生理盐水洗涤3次，最后用生理盐水配成2%的致敏SRBC悬液。

2．间接血凝试验操作程序（单位：ul）

管号 1 2 3 4 5 6 7

生理盐水25 25 25 25 25 25 25 1：10O(H)血清25 25 25 25 25 25 25 致敏SRBC 25 25 25 25 25 25 25 终血清稀释度1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 1：2560 3.结果观察：

-：细胞沉积于孔底。

+ ：细胞沉积于孔底，周围有少量散在凝集。

++：细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散。

+++：细胞形成片层凝集，面积略大于2+ 。

++++：细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘皱缩如花边状。

4．方法评价：快速、敏感、操作简便且无需特殊实验设备。

临床应用：间接凝集试验在临床检验中应用广泛，

（1）检测抗原

（2）检测抗体，如抗-HIV抗体、抗溶血素“O”抗体等，类风湿因子、抗DNA抗体等自身免疫性疾病的抗体和青霉素抗体等变态反应的抗体，主要用于检测抗病原生物抗体，如抗脑膜炎球菌、沙门菌、志贺菌、结核杆菌、肝炎病毒、流感病毒、血吸虫等病原体的抗体。

课程小结

颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下发生反应，出现肉眼可见的凝集小块，称为直接凝集反应。在操作方法上有玻片法和试管法两种。玻片法以已知诊断血清检测未知细菌颗粒性抗原为例；试管法以检测抗体效价为例。试管法倍比稀释，使抗血清浓度呈倍数关系逐步降低。

将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关、大小均匀的载体颗粒表面，再与相应抗体在适宜条件下相互作用，可发生抗原抗体反应而使颗粒被动的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，这种方法称间接凝集试验。如将抗体吸附于颗粒表面用以检测抗原，则称为反向间接凝集试验，方法和原理与前者相同。实验室常用的载体有红细胞、胶乳颗粒等。以红细胞为载体颗粒的间接凝集试验称为间接血凝试验。