第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
重组体筛选和鉴定PPT课件
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
基因的转移与重组体的筛选和鉴定
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
重组子的筛选与鉴定
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
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第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
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• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
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1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
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半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
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重组体的筛选第四章
Genetic phenotype selection
Sub-cloning selection
Immunochemical selection
Electrophoresis selection
遗传表型 筛选法
Molecular hybridization selection
重组体的筛选方法 The methods of rebinant selection
选择（selection）与筛选（screening）
筛 选 细胞群中进行鉴定 （蓝白筛选）
选 择 选择压力 （抗药性的选择）
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为什么要进行重组体的筛选？
01
PEPORT ON WORK
③ 自身环化的载体分子
⑤ 需要的重组DNA分子
连接体系
① 未连接上的载体分子
② 未连接上的DNA片段
④ 连接污染DNA片段 的重组DNA分子
宿主细胞108（转化率10-6）
100个转化子 9 999 900个未转化的细胞
利用质粒的抗生素基抗性因进行筛选
能够在含有抗生素培养基上生长
100个转化子
①目的重组DNA分子 ②连接污染DNA片段的重组DNA分子 插入失活法 ③自身环化的载体分子
外源DNA片段同载体分子的重组
衔接体（linker)
同聚体加尾 （homopolymer）
外源DNA片段同载体分子的连接方法 平末端 粘性末端
结合体 （adaptor)
1
2
3
4
5
第一节 重组 DNA导入受体细胞
二、受体细胞
1、受体细胞(receptor cell)的概念 2、受体细胞的选择原则 1）便于重组DNA的导入 2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中 3）便于重组体的筛选 选择与载体所含的选择性标记相匹配的受体细 胞基因型 4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长
微生物遗传育种(1)
微生物遗传育种答案第一章微生物的遗传物质一、名词1 转化: 指一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而发生遗传性状的改变2 cccDNA——共价、闭合、环状DNA3 复制子：指能独立进行复制的DNA部分, 一个复制子包括复制起点及其复制区4 启动子(promoter)——是位于结构基因5’端,启始结构基因转录的DNA顺序。
它决定转录的准确启始,并与转录效率有关。
5 Pribnow框(Pribnow box): 又称-10区或Rc区，与核心酶结合的位置，一致顺序：TATPuA二、问题1证明核酸是遗传物质有哪些实验证据答：肺炎双球菌的转化实验和噬菌体的侵染实验证明DNA为遗传物质。
烟草花叶病毒的遗传物质的发现及重组实验证明RNA也是遗传物质。
2 1928年, F Griffith 发现转化现象的过程答：肺炎双球菌野生型，有毒力菌落光滑产荚膜为S型；突变型无毒力菌落粗糙无荚膜为R 型，然而讲加热杀死的S型细菌与R型细菌混合培养，能分离得到S型细菌，说明加热杀死的S型菌中存在能将R型菌转化为S型菌的因子。
3 1944年，Avery证明DNA是遗传物质的过程答：Avery他们从S型细菌细胞物质中抽提并纯化出转化因子，将它用多种蛋白水解酶处理后，并不影响转化效果，如果用脱氧核糖核酸酶去处理则转化消失，从而直接证明了转化因子是DNA.四、选择题：1 E.coli含有一个cccDNA，约编码2000个基因。
2 E.coli的基因组测序1997年完成，E.coli cccDNA 有基因4.6×106 bp,含4288个基因第二章基因突变和损伤DNA的修复一、名词1基因突变(gene mutation) : 是指基因的分子结构(核苷酸顺序)的改变1.形态突变——可见突变2.生化突变：指没有形态效应的突变（去年考题）3.致死突变：指引起个体死亡或生活力下降的突变4.条件致死突变：指在某些条件下能成活, 而在另一些条件下是致死的突变二、问题1根据突变对表型的效应，基因突变分为哪些类型？（去年考题）答：1形态突变：肉眼可见，即有关形状、大小、生育状态、颜色、颜色分布等表型变化的突变；2：生化突变：没有形态：指没有形态效应的突变；3致死突变：引起个体死亡或活力下降的突变4：条件致死突变:指在某些条件下能成活而在另一些条件下是致死的突变。
基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
微生物遗传学M.G.第四章、3,4节
(二）性别体制和基因重组 1、S.c. A3 菌株的性别体制 S.c. A3 菌株 scp1scp1＋ scp1－NF scp1’ 相当于E.coli FF＋ Hfr F’ 最初的命名 UF IF NF －
UF:Ultra Fertility (超致育型)
IF: Initial Fertility (原始致育型)
一、链霉菌染色体DNA
1、特征： 一条染色体，DNA为线性，基因内部无内 含子，平均大小为8Mb，约含7000个基因。
染色体的2个末端具有很长的反向重复序 列，简称TIR ( terminal inverted repeat),TIR通常的长度为24～600Kb。
每条DNA链的5’端都有共价结合蛋白，简称 TP (terminal protein)。TP与TIR组成的复合 体结构称为端粒(telomere)。
异核系（heteroclone） 是指一个部分二倍体（杂合核）在分裂过程中 发生染色体交换和减数，结果在同一菌丝体上 形成各种单倍重组体孢子，由此形成的菌落称 为异核系。 异核系是放线菌基因重组特有的现象，菌落很 小，产生的分生孢子包括许多不同的重组类型。 异核系来源于一个线形的部分杂合二倍体。 （图6－17）
Transduction is the term used to designate the bacteriophage-mediated transfer of DNA from one cell (a donor ) to another cell (a recipient). 转导是以噬菌体作为媒介，将一个细菌的基 因导入另一个细菌的过程。
杂交分析 S.coelicolor SCP1-NFXSCP1- 杂交后，供体基 因在受体中出现的频率呈双向梯度现象。 p.156,图6－15
第四章 目的基因的分离克隆
第四章 目的基因的分离克隆一般认为基因克隆，主要包括以下几个过程：①DNA片段的分离、纯化，即目的基因的制备；②外源DNA片段与载体DNA分子的体外连接；⑧人工构建的重组体向寄主细胞内的转移；④重组克隆的筛选和鉴定。
第一节 化学法合成目的基因这种方法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。
随着蛋白质和DNA序列测定技术的发展，越来越多的基因结构已被测定出来，重组DNA技术的发展也有力地推动了基因化学合成的研究，特别是各种DNA自动合成仪的问世，大大地改变了化学合成基因的面貌；从最初只能人工合成15bp的寡核苷酸片段，到目前可以利用自动合成程序合成长达200bp的寡核苷酸片段。
利用DNA连接酶的作用，甚至可以合成和组装更长的基因片段。
到目前为止，已经成功地合成了数十种基因。
目前基因合成更多的是由DNA自动合成仪来完成.第二节 PCR技术在基因克隆中的应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。
该反应是一指数式反应，其可在短时间内使目的片段的扩增量达到106倍，可从极微量的DNA乃至单细胞含有的DNA起始，扩增出ug级的PCR产物。
自20世纪80年代中期PCR技术问世以来，迅速渗透到了分子生物学的各个领域，现已在基因克隆、外源基因的整合检测、物种起源、生物进化等方面得到了广泛应用。
本节将对PCR的基本技术及在基因分离克隆中常用的PCR方法加以介绍。
一、PCR基本技术1．PCR原理利用PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，是通过3个温度依赖性步骤完成的反复循环。
反应共分3步进行： （1）变性(denaturation)，即双链DNA在94℃下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。
（2）退火(annealling)，即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物与模板DNA互补序列杂交。
重组体的筛选与鉴定
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶
乳糖
半乳糖
葡萄糖
Xgal
半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
+
+
深蓝色
1. 原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。
单链mRNA
核糖体 大亚基
能翻译
mRNA
DNA
核糖体 大亚基
不能翻译
1. 原理
2. 过程
四、杂交释放转译法
1. 原理：
1. 原理：
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
（2）氨苄青霉素抗性基因：
含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗
四、免疫印迹（western blotting）法
1.原理：
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
重组DNA的转化与筛选
第四章重组DNA的转化与筛选载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：a. 未连接的载体分子b. 未连接的DNA片段c. 载体的自连d. 含有错误插入片段的重组DNA分子e. 重组DNA分子转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。
未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。
自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制。
因此，需要将重组克隆鉴定出来。
第一节细菌的转化方法自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和吸收的代谢机制。
正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法：a. 热激法转化感受态细胞b. PEG介导的原生质体转化c. 高压电穿孔法转化d. 显微注射法转化e. 接合转化f. 噬菌体转染表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较图4-1 热激法转化感受态的过程一、受体细胞应具备的条件a. 限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）b. 重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）c. 具有较高的转化效率d. 具有与重组体互补的遗传性状e. 感染与寄生缺陷型安全角度的要求。
二、大肠杆菌感受态的制备与转化转化的突破发生在1970s的早期，研究发现，在冷的盐溶液中转化的效率提高。
一般利用50mM的CaCl2，其他的盐如氯化铷也有较高的效率。
经过处理的细胞称为感受态细胞。
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
目前，机理尚不清楚，可能是CaCl2导致DNA分子沉淀到细菌细胞的外壁上，或者CaCl2与提高细菌结合的变化有关。
实验17-重组体筛选与鉴定
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
三 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴 30分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬
重组体的筛选和鉴定
二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
基因重组
（一） 接合作用（conjugation)
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转 移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为 接合作用。
（二）转化作用（transformation)
通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传 表型。
分离
粘端连接
平端连接
目的基因粘端 5’—A 3’— TTCGA—
运载体DNA粘端 AGCTT— A—
DNA连接酶
5’—AAGCTT— 3’—TTCGAA—
末端转移酶
退火
三、重组体引入受体细胞 转化、转染.利用抗药基因进行初筛
2.限制酶切图谱分析（指纹图谱法）
提取重组体DNA 提取运载体DNA
DNA
RH 型 肺炎双球菌
SH 型 肺炎双球菌
（三）转导作用（transduction)
当病毒从被感染的细胞（供体）释放 出来，再次感染另一细胞（受体）时， 发生在供体细胞与受体细胞之间的 DNA转移及基因重组。
（四）转座（transposition)
大多数基因在基因组内的位置是固定的， 但有些基因可以从一个位置移动到另一 位置。这些可移动的 DNA序列包括插入 序列和转座子。由插入序列和转座子介 导的基因移位或重排称为转座。
从原位迁至新位 2. 复制性转座
插入序列复制后，一个复制本迁 到新位，另一个保留在原位。
（二）转座子转座 转座子（transposons）：可从一个染色体位
点转移到另一位点的分散重复序列。 反向重复序列
组成 转座酶基因 特殊基因：如抗生素抗性基因等
转座酶基因
特殊基因
（五）同源重组
发生在同源序列间的重组。同源重 组不依赖特异DNA序列，而依赖同 源性。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
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第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的 CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源 DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量 0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。
每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。
（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。
首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。
整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。
尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。
（4）转化率的计算及其影响因素转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率有两种表示方式：A：以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示B：以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。
以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率A：通过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。
B：计算转化子与受体菌的比率。
用于制备感受体细胞的菌液每毫升有5×107个菌体，则4 ml菌液有2×108个菌体，由此菌液制备成感受态细胞，通过转化处理，获得1000个转化子，则转化率是103／（2×108）＝5×10-6。
其含义是每个受体菌细胞被转化的概率是5×10-6，或者说，要得到一个转化子，需要2×105个受体菌细胞。
每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示单位通常是转化子数每μg DNA分子，如每μg重组DNA分子获得106个转化子，则转化率为106个/ μg DNA分子。
影响转化率的因素：分子量载体类型及构型重组DNA分子的浓度与纯度受体细胞2. 重组λ噬菌体DNA子转导大肠杆菌转导（transduction）是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA 分子转移到受体细胞内的过程。
λDNA与外壳蛋白结合成噬菌体颗粒，才有转导宿主大肠杆菌的能力。
因此重组的λDNA必须进行体外包装。
所谓体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包裴为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。
在实验方法上，体外包装包括两个方面：（1）包装抽提物的制备；（2）体外包装过程。
二、重组DNA分子转入真核细胞1. 根癌农杆菌Ti质粒介导法农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。
迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。
农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。
植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－As），它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。
具有趋化性的农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA的转移至细胞内部。
根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进人植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
步骤：（1）外植体选择与预培养；（2）接种活化的农杆菌工程菌；（3）共培养；（4）选择培养；（5）转化植株再生2. 高压电穿孔法利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。
利用这种方法，可以将DNA 导入动、植物及细菌细胞。
具有简单方便、对细胞毒性低以及转化效率高等优点。
（1）标准的操作程序——将高浓度的含有克隆基因的质粒DNA加到原生质体的悬浮液中，然后置于200～600V／cm的电场下进行电脉冲刺激。
经过如此电穿孔处理的原生质体在组织培养基中培养1～2星期之后，选择已经捕获了转化DNA的细胞，作进一步的继续培养，以便获得再生植株。
应用这种方法已成功地转化了玉米和水稻的原生质体，其转化效率在0．1％～1．0％之间。
（2）影响电穿孔导入DNA效率的因素：①外加电场的强度：250～750 V／cm较宜；②电脉冲的时间：20～100ms；③工作温度：对不同类型细胞所要求的条件不同，可以在0℃至室温（25℃）之间进行选择；④ DNA的构象和浓度：线性 DNA比环状 DNA要好，浓度控制在1～40 μg／mL。
⑤工作缓冲液的离子成分：也对其DNA导入效率发生作用，一般用盐溶液悬浮细胞要比用非离子溶液更易DNA的导入。
3. 聚乙二醇介导的原生质体转化法这种方法常用于转化酵母细胞以及其他真菌细胞。
活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形体后，在适当浓度的聚乙二醇6000（PEG－6000）的介导下，将外源DNA转化入受体细胞中。
4. 磷酸钙或DEAE一葡聚糖介导的转染这是将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。
将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后通过内吞作用进入受体细胞。
对于DEAE-葡聚糖作用的机理尚不清楚，可能是其与DNA结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进DNA的内吞作用。
5. 原生质体融合通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。
经过细胞膜融合，细菌内容物转入动物细胞质中，质粒DNA被转移到细胞核中。
6. 脂质体法将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。
脂质体是由磷脂组成的膜状结构，用它包装外源DNA分子，然后与植物原生质体共保温。
于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，尔后通过细胞的内吞作用而将外源DNA高效地纳入植物的原生质体。
这种方法具有多方面的优点，包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。
用此法转化水稻原生质体的效率可达14％，并得到了转基因的再生植株。
7. 显微注射法借助显微镜将外源DNA直接注射到受体细胞的方法。
适用于此种方法的植物样品包括原生质体、游离的细胞，以及诸如愈伤组织、分生组织和胚胎组织等多细胞结构。
在显微注射的实际操作中，受体细胞或组织是被固定在褐藻酸钠或琼脂糖等特定载体上，然后通过显微操作器，将转化的外源DNA直接注射到受体细胞核中去。
由于一些重要的禾本科粮食作物均为单子叶的，在原生质体再生和Ti质粒的转化方面都存在着相当的困难，所以对此类植物来说，DNA的直接注射法具有特别重要的实用价值。
本法的一个突出优点是转化频率高，可达60％以上，但操作困难，需要经过特殊训练的专门技术人员才能迸行。
8. 颗粒轰击（particle bombardment）技术颗粒轰击技术是将基因转移到细胞或组织中去的通用方法，也就是平常所说的用基因枪实现基因转移的方法。
将DNA包被在金或钨的微粒中，然后用基因枪将DNA包被的颗粒直接转移到原位组织、细胞乃至细胞器中去。
这一技术目前广泛用于植物基因工程、基因治疗以及基因（DNA）免疫等研究。
生物弹击法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和培养转基因植物的最有效的手段之一。
第二节基因重组将目的基因插入载体的过程，即基因重组（gene recombination)，其基本过程包括：首先在目的目的基因和载体两端造成切口，然后依赖于双链DNA粘性末端单链序列的互补结合和DNA连接酶将切口补上。
这一步的实质就是将两种DNA在体外进行酶促连接，最终获得一个重组子。
一般连接反应中外源DNA与载体的比例采用3：1，4：1或5：1。
不同来源、性质的外源片段采用的连接方式不同。
常采用的连接方法有：粘末端连接、平端连接法、人工接头法和同聚物接尾法。
一、粘末端连接1. 全同源粘性末端连接如果目的序列与载体两端具有相同的限制内切酶位点，则同一限制性核酸内切酶酶切后在目的基因与载体两端产生完全相同的粘性末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列与载体DNA连接，实现基因重组，称为全同源粘性末端连接。
另外，不同的限制性内切酶，如果产生的粘性末端相同，也同样用此方法连接。
该连接方法的优缺点为：优点：该方法是最方便的克隆方法，其连接效率高，一般采用低浓度酶在低于16度，高浓度ATP的情况下进行连接。
缺点：容易出现载体自身环化、双向插入（即目的基因以两种方向插入载体和多拷贝插入的现象，从而在转化后出现高背景，使得筛选更为困难。