流式细胞分选原理与应用

流式细胞分选原理与应用

北京大学医药卫生分析中心

吴后男

2010. 04. 26

教学邮箱：cell-2009@ 密码：82802389

Tel : 8280 5034 or 2437

第一部分分选仪结构与原理

●流式细胞分选技术（Flow Cytometry，FCM）

利用分选仪检测单细胞或生物颗粒的多种特异性荧光信号，并针对同样荧光信号特性的细胞亚群从总细胞群体中分离和富集的高科技细胞分析技术。

●高速分选特点

1. 检测对象：荧光素标记单个细胞悬液

2. 分选速度快：5万个细胞/秒

3. 分选纯度高：99%以上

4. 回收率高：＞80%

5. 同时检测单细胞(single)内多种信息：膜、浆、核

●分选仪主要厂商

1. 美国BD公司(Beckton Dickinson)

▲1973年第一台问世：FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter）

▲1980年中国第一台：FACS II

▲市场占有率：全球75%，中国70%

2. 贝克曼库尔特公司（Beckman Coulte）

中国30%，目前呈逐年上升趋势

●分选仪内部结构

一、光学系统

1.激发光源：激光器

▲气体：氩离子（488nm）、氦氖（633nm）、氪离子

（647nm）、氪氩（568nm）

▲染料：如氩离子激光泵浦的Rhodamin 6G水溶液染料，激

发出550-650nm可变波长激光

▲半导体：价格低、结构简单、寿命长，但功率较低。现

已广泛应用。如：BD的FACS Calibur、Aria已

采用固体激光器

2.光收集系统

滤光片

Trigons and Octagon

二、液流系统

1.流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交

2.液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器

FACS Aria 液流系统流程图

三、电子系统

1.光电转换器:将光信号转换为电信号

光电二极管：光灵敏度低，测定强信号（FSC）

光电倍增管（PMT）：放大电信号,光灵敏度高，测

定弱信号（SSC、FL1、FL2、FL3、FL4）前置放大电路：输出电脉冲信号

模数转换电路：将模拟的峰值转换为数字化信号

2.数据处理系统：计算机系统数据采集、分析

电脉冲定量

脉冲高度分析和数字转换

四、分选系统(电荷式)

●分选原理（电荷式）

●流式细胞仪信号检测

1.散射光信号（FSC、SSC）：物理或固有参数

2.荧光信号：自发荧光+ 特异荧光

●流式细胞术操作流程：

●分选范围及用途

范围：

▲普通细胞分选

▲干祖细胞分选

▲染色体分选

▲性别选择（精子分选）

▲胎儿红细胞产前诊断

▲单克隆细胞分选

▲成分分选

用途：

▲形态学研究

▲纯化细胞传代培养

▲分子生物学研究（FISH、PCR）

▲细胞功能研究

第二部分分选技术应用

▲细胞生物学

▲免疫学

▲遗传学

▲药理学

▲肿瘤学

▲血液学

▲病理学

▲临床检验

▲植物学

▲海洋生物学

▲食品

▲制药工业

▲农业畜牧业

GFP转染细胞分选

基因转染细胞分选

人外周血CD4+、CD8+、非T淋巴细胞分选小鼠胸腺基质细胞分选

人CD4+CD25+ T淋巴细胞分选

CD4+T细胞功能亚群分选(5标)

增殖期淋巴细胞分选

❖与细胞膜结合

❖细胞分裂后，染料平均分配到两个子细胞中❖CFSE (FL1)

❖PTIR271(FL2)

二路分选纯度验证

四路分选纯度验证

Post-Sort