微生物限度检验方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
微生物限度检查方法适用性验证方案
目录1.概述 (2)1.1验证目的 (2)1.2验证频次 (2)1.3适用范围 (2)1.4参照标准 (2)1.5验证小组人员及职责 (2)2.试验前准备 (3)2.1验证所需的文件资料 (3)2.2验证条件 (3)2.3回收试验 (5)2.4结果判断 (7)1.概述1.1验证目的进行产品的微生物计数检查时，应进行方法适用性试验（即微生物回收试验），以确认所采用的方法适合于微生物限度检查。
本次验证的目的就是确认本法适合生产原料、初包装材料、一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查。
1.2验证频次1.2.1建立生产原料、初包装材料一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查法时。
1.2.2检验方法更改时。
1.2.3原料、初包装材料、产品发生变化或检验程序发生改变时。
1.3适用范围生产原料、初包装材料、一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查。
1.4参照标准2015版《中国药典》第四部通则。
2.验证前准备2.1验证所需的文件资料2.2验证条件2.2.1环境要求微生物计数检查在万级洁净区内的百级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区与工作台面必须进行洁净度验证。
2.2.3验证用培养基所有培养基均采用即用型培养基，临用时按使用说明使用。
2.2.4验证用菌株：菌种来源（）2.2.5菌液制备-表3-接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35℃培养18〜24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20〜25℃培养24〜48小时，上述培养物用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氣化钠溶液制成每lml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位）的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，加入3〜5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9% 无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。
微生物限度检查方法适用性验证方案
微生物限度检查方法适用性试验方案验证方案组织与实施微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。
方案起草方案审核方案批准目录一、概述二、验证目的和风险评估三、验证内容四、方法判定五、再验证周期六、参考文献七、结果评价及结论1、概述：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。
依照中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。
2、试验目的和风险评估：验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。
风险评估：3、验证内容：3.1、培养基来源：确认人：确认日期：3.2、检查用培养基配制方法：确认人：确认日期：3.3、使用仪器确认人: 确认日期：3.4、验证试验用菌种：确认人：确认日期：3.5试验方法：取供试品10 ml加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。
需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。
3.6菌液的制备：3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证是一种用于确定化妆品和药品中微生物污染水平的方法。
这种验证方法用于确定产品是否符合微生物限度规定，并确保产品的安全性和质量。
微生物限度方法学验证的步骤包括：
1. 根据相关规定选择适当的微生物限度测试项目。
常见的微生物测试项目包括总生菌数、霉菌和酵母菌、大肠菌群等。
2. 准备适当的培养基和培养条件，以促使微生物在培养基上生长。
3. 从样品中获取适当的微生物培养物。
样品可以是产品中的一部分或整个产品。
4. 在适当的培养基上接种微生物培养物。
5. 在适当的环境条件下孵育培养基，以促进微生物生长。
6. 定期检查培养基的生长情况，包括观察菌落形态和计数菌落数量。
7. 将菌落转移到适当的检测方法中，如涂抹法、膜过滤法等。
8. 使用适当的培养基和培养条件，在适当的温度和pH条件下，观察和计算培养基上的微生物生长数量。
9. 比较结果与规定的微生物限度标准，确定产品是否符合要求。
微生物限度方法学验证可以帮助制药和化妆品行业确保产品的微生物质量，并确保产品在使用过程中不会对消费者的健康有害。
这种验证方法需要严格的实验室操作和合理的测试标准，以确保结果的准确性和可靠性。
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案 Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
微生物限度检查方法验证方案
微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。
4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。
4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
微生物限度检查方法适用性试验方案
微生物限度检查方法适用性试验方案一、试验目的本试验旨在验证微生物限度检查方法的适用性，并评估其在实际样品中的准确性、精密度和灵敏度，以确保检测结果的可靠性。
二、试验范围本试验适用于各类药品、食品、环境以及生物制品等样品的微生物限度检查。
三、试验设备与试剂1. 培养基：本试验需使用适当的培养基，如大肠杆菌培养基、沙门氏菌培养基等，以满足特定微生物的培养需求。
2. 灭菌设备：试验中的培养基、工具及试剂需经过灭菌处理，以保证试验环境的无菌状态。
3. 微量移液器：用于准确取样和移液，确保实验的精确性。
4. 微生物培养箱：用于提供适宜的温度和湿度条件来培养微生物样品。
四、试验步骤1. 样品制备：按照相关规定和标准采集样品，并根据不同样品的特性进行适当处理，以便得到具有代表性的样品。
2. 培养基接种：将样品按照试验要求接种到相应的培养基中，并在一定条件下进行培养，以促使微生物生长。
3. 培养基培养：将接种过样品的培养基置于微生物培养箱中，根据微生物的生长特性进行培养，通常包括温度、湿度和培养时间等方面的控制。
4. 结果观察与记录：根据实验要求，观察培养基上是否有微生物的生长，并记录对应的观察结果。
5. 试验数据处理与分析：根据试验结果进行数据处理与分析，并评估微生物限度检查方法的适用性、准确性和灵敏度。
五、试验评价指标1. 准确性：通过与参考方法的比对，评估限度检查方法的准确程度。
2. 精密度：利用不同实验者、设备和试剂的重复试验，评估方法的可重复性和稳定性。
3. 确定度：评估方法的灵敏度和特异性，以确定方法对微生物的检测能力。
4. 可靠性：综合以上评价指标，评估方法在实际应用中的可靠性和适用性。
六、试验结果与分析根据试验评价指标，通过一系列试验和数据分析，我们可以得出以下结论：1. 限度检查方法在各类样品中的准确性良好，能够准确反映样品中微生物的含量。
2. 试验结果表明，方法具有较好的重复性和稳定性，不同实验者、设备和试剂的试验结果相对一致。
微生物限度检查方法适用性试验方案
微生物限度检查方法适用性试验方案微生物限度检查是一种常用的检查方法，用于评估药品、食品和化妆品等产品中微生物的污染程度。
微生物限度检查方法的适用性试验是为了验证检测方法的准确性、可靠性和适用范围。
本文将介绍微生物限度检查方法适用性试验的方案。
一、试验目的验证微生物限度检查方法的适用性，评估方法的准确性、可靠性和适用范围。
二、试验范围该试验适用于药品、食品和化妆品等产品的微生物限度检查方法。
三、试验方法1.试验材料准备a.研究所需的试验材料，包括样品、菌株、培养基等。
b.样品的处理，根据具体要求进行处理，如稀释、过滤等。
2.实验操作a.样品处理：根据样品的特点进行处理。
b.菌株培养：选取试验使用的菌株，按照适当的培养方法进行培养，确保菌株的活力和纯度。
c.培养基准备：根据具体需要，配制适当的培养基，确保培养基的质量。
d.接种和孵育：将处理后的样品接种到培养基中，并根据不同的微生物进行适当的孵育条件，培养出适量的微生物。
e.培养液的传递：取适量的培养液，经过适当的稀释、过滤等处理，得到试验所需要的样品。
f.复苏：对可能受到不利条件或致死处理的微生物进行复苏，以评估方法的准确性和敏感性。
g.灭菌试验：对培养基等试验材料进行灭菌试验，确保试验材料的无菌性。
3.检测方法验证a.准确性验证：通过添加已知数量的微生物到样品中，检测方法应能准确有效地检测出添加的微生物。
b.反应性验证：通过将不同的菌株添加到样品中，检测方法应能对不同菌株有较好的反应性。
c.选择性验证：通过将其他微生物添加到样品中，检测方法应能对目标微生物选择性地进行检测。
d.灵敏度验证：通过不同浓度的微生物添加到样品中，检测方法应能有效地检测出微生物的存在。
四、试验报告要求试验报告应包括以下内容：a.试验目的、试验范围和试验方法的简要介绍。
b.所使用的试验材料和设备的详细说明。
c.试验过程的详细记录，包括样品的处理、菌株的培养、培养基的准备等。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查法验证方案1。
目的:为确认所采用的方法适用于药品微生物限度检查，包括细菌、霉菌、酵母菌和对照菌的计数，特制定本验证方案。
通过比较试验菌的复苏生长结果，评价整个试验方法的准确性、有效性和重现性，从而确定试验样品在实验条件下无抑菌活性或抑菌活性可忽略不计。
所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本计划规定的内容进行。
因特殊原因确需变更的，应填写《验证计划变更申请书》，报验证领导小组批准。
2.范围: 本验证计划适用于微生物限度检查方法的验证。
3。
规范性引用文件:根据《中国药典》XXXX版附录二附录九J微生物限度检查法的要求，由于部分试验品的抗菌活性，当已建立的微生物检查方法或产品的成分发生变化或原检查方法的检查条件发生变化时，可能会影响检查结果的准确性。
因此，必须验证测试物品的抗菌活性和测试方法的可靠性。
4.验证和实施:4.4.1试验前准备:4.4.1.1试验设备的准备:试管、刻度移液器、薄膜过滤器、滤膜(孔径0.22um，直径50毫米)、平皿、空三角瓶、称重纸等。
试验要求用牛皮纸包裹，放在湿热灭菌器中，在121℃灭菌30分钟，3天内使用4.4.1.2试验培养基的制备:取脱水培养基如营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖醛酸苷培养基(MUG)等经适用性检验合格的脱水培养基，按相应的制备说明用纯净水配制，分装，2小时内放入湿热灭菌器中，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.1.3试验用稀释液/缓冲液和冲洗液的配制:取有效期内的试剂，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%(毫升/毫升)聚山梨酯80无菌氯化钠溶液和0.05%(毫升/毫升)0.9%氯化钠溶液等。
按照相应的制备方法，用纯净水配制，加热溶解，过滤，分装，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.2试验菌的制备和稀释:4.4.2.1细菌、霉菌和酵母菌计数法验证菌液:4.4.2.1.1取少量新鲜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，接种于10毫升营养肉汤中，在30-35℃培养18-24小时；将新鲜白色念珠菌培养物接种到改良的马丁培养基中，在23-28℃培养24-48小时；将黑曲霉的新鲜培养物接种到改良的马丁琼脂斜面培养基上，在23-28℃培养5-7天4.4.2.1.2将上述大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的均匀培养物(细菌悬液)用0.9%无菌氯化钠溶液稀释两次，以制备每毫升细菌含50-100伏的测试细菌溶液。
微生物限度检验
2007.4
1
微生物限度检查 (Microbial Limits Test) ：
是指非无菌制剂及原，辅料受到微生物污染程度的检查。 包括：
1）细菌计数； 2）霉菌及酵母菌计数； 3）控制菌检查：大肠杆菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡 萄球菌，大肠菌群
2
细菌、霉菌及酵母菌计数
大肠杆菌 1g (1ml)样品 样 100ml 胆盐乳糖 培养基 35-37 ℃,18-24h 大肠菌群 1g (1ml)样品 样 3X10ml 胆盐乳 糖发酵管 35-37 ℃,18-24h 沙门菌 10g (10ml)样品 样 200ml 营养肉汤 营养肉 铜绿假 铜绿假单胞菌 1g (1ml)样品 样 100ml 胆盐乳糖 培养基 35-37 ℃,18-24h 金黄色葡萄球菌 1g (1ml)样品 样 100ml 亚碲酸钾 碲酸钾 肉汤 (或营养肉汤) 或营养肉 35-37 ℃,18-24h 梭菌 1g (1ml)样品X2 样 (其中一份样品80 其中一份样 其中一份 ℃,10分钟) 分 100ml 新鲜庖肉 培养基 厌氧, 35-37 ℃,72-96h
8
验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件 检验方法
检验规程
样品量 稀释液种类 稀释液体积 中和剂 培养基 培养时间 培养温度 ……
SOP
9
影响微生物检验的因素
- 样品/药品自身的特殊性 - 样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂 - 培养基的特性 - 培养条件 - 人员因素 - 实验器材的选择
甘露醇氯 甘露醇氯化钠琼 脂 (或卵黄氯化钠琼 或卵黄氯 或卵黄 脂) 35-37 ℃,18-72h
0.2ml 涂抹于 含庆大霉素的哥 亚琼脂 伦比亚琼脂 厌氧, 35-37 ℃,48-72h
中国药典微生物限度检查方法验证方案
中国药典微生物限度检查方法验证方案一、引言药品的质量与安全性是保障患者用药安全的重要方面。
微生物限度检查是药品质量控制的重要环节，用于评价药品中微生物的污染情况。
为确保检测结果的准确性和可靠性，本文旨在制定中国药典微生物限度检查方法验证方案。
二、背景微生物限度检查方法验证是指确定某一方法在特定条件下的适用性，方法验证的结果直接影响到药品生产和品质控制。
为了保证方法验证的可靠性，必须按照一定的规范和要求进行操作。
三、验证目的验证中国药典中所规定的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性，以确保药品的微生物限度符合国家及相关法规的要求。
四、验证程序1. 确定验证方法：根据中国药典中规定的微生物限度检查方法，选择合适的验证样品和验证条件。
2. 准备验证样品：从实际生产过程中随机选取药品样品，确保样品的代表性。
3. 执行验证实验：按照中国药典中的方法操作，对验证样品进行微生物限度检查。
4. 数据分析和评估：根据验证实验的结果，进行数据分析和评估，评估方法的准确性和可靠性。
5. 结果判定：根据数据评估结果，对微生物限度检查方法进行判定，判断方法是否适用于实际生产中的微生物限度检查。
6. 验证报告编制：根据验证实验的结果和结论，编制验证报告。
五、验证内容本次验证主要包括如下内容：1. 对选择的验证样品进行微生物限度检查。
2. 对验证样品进行菌落计数。
3. 对验证样品进行培养方法的验证。
4. 对不同微生物种类的检查方法进行验证。
5. 对不同微生物菌株的适应性进行验证。
六、风险评估在验证过程中，存在一定的风险因素，需进行风险评估，确保验证结果的可靠性和准确性。
风险评估主要包括验证样品来源的可靠性、实验操作的准确性、验证条件的合理性等。
七、验证结果与讨论根据验证实验的结果和数据分析，可以得出下列结论：1. 所验证的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性较高。
2. 所验证的微生物限度检查方法适用于不同药品制剂类型的微生物限度检查。
微生物限度检查方法适用性验证方案
微生物限度检查方法适用性验证方案适用性验证是指对微生物限度检查方法所应用范围进行验证，确保方法适用于具体药物产品的检测。
适用性验证需要涉及以下几个方面：1.准确性：准确性是微生物限度检查方法的基本要求。
验证方法的准确性需要进行重复性和中间精密度实验，确保在一定条件下对同一药物样品进行测试时，结果之间具有较高的一致性和准确性。
2.灵敏度：灵敏度是指微生物限度检查方法能够检测到微生物数量的最低限度。
灵敏度验证需要使用一系列稀释溶液，以确定方法可以可靠地检测到微生物的最低限度。
3.特异性：特异性是指微生物限度检查方法只对目标微生物有反应，不受其他微生物的干扰。
特异性验证需要进行对照实验，验证方法能够正确地检测出目标微生物，并排除其他微生物的干扰。
4.精密度：精密度是指方法的重复性和中间精密度。
重复性验证需要多次重复测定同一样品，验证方法在相同条件下的结果具有较高的一致性；而中间精密度验证需要在不同的实验室、不同仪器、不同操作人员下进行测试，验证方法在不同条件下的可靠性。
5.稳定性：稳定性是指方法在一定时间范围内的稳定性。
稳定性验证需要在一定时间范围内对同一样品进行测试，并比较结果的一致性，以确保方法的可靠性和稳定性。
在实施适用性验证时需要注意以下几个方面：1.选择合适的药物样品进行验证，确保样品具有代表性和典型性。
2.严格控制实验条件，包括试验环境、温度、湿度等，以减少实验条件对结果的影响。
3.提高实验人员的技能水平，确保实验人员具有足够的实验操作技能和知识背景。
4.在验证过程中及时记录实验数据，并进行统计分析，确保结果的可靠性和准确性。
5.与相关法规和标准保持一致，确保验证方法的合规性和可靠性。
适用性验证是确保微生物限度检查方法准确性和可靠性的重要环节。
通过适用性验证，可以确保所采用的方法能够可靠地检测药物产品中的微生物限度，从而保证药品的质量和安全性。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。
3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。
5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。
验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。
适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。
6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。
具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
微生物限度检查方法适用性验证方案
微生物限度检讨办法实用性实验计划验证计划组织与实行微生物限度检讨办法实用性实验工作应由质量治理部分负责组织,质量治理部分有关人员构成验证小组,介入实行.计划草拟计划审核计划同意目录一、概述二、验证目标和风险评估三、验证内容四.办法剖断五.再验证周期六.参考文献七.成果评价及结论1.概述：微生物限度检讨法系检讨非划定灭菌制剂及其原料.辅料受微生物污染程度的办法.检讨项目包含需氧菌数.霉菌数和酵母菌数及掌握菌检讨.当树立产品的微生物限度检讨法时,应进行需氧菌.霉菌和酵母菌计数办法的实用性实验和掌握菌检讨办法的实用性实验,以确认所采取的办法合适于该产品的需氧菌.霉菌和酵母菌数的测定和掌握菌检讨.按照中国药典2015版,需氧菌.霉菌和酵母菌及掌握菌均采取平皿法进行办法实用性实验.2.实验目标和风险评估：验证目标：确认所采取的需氧菌.霉菌和酵母菌计数办法及掌握菌检讨办法合适我公司所临盆产品的微生物限度检讨.风险评估：3.验证内容：3.1.造就基起源：确认人：确认日期：3.2.检讨用造就基配制办法：确认人：确认日期：3.3.应用仪器确认人: 确认日期：3.4.验证实验用菌种：确认人：确认日期：3.5实验办法：取供试品10 ml加至100ml→1:10供试液.需氧菌.霉菌和酵母菌.掌握菌采取通例法.3.6菌液的制备：取金黄色葡萄球菌.铜绿假单胞菌.大肠埃希菌.枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵,参加胰酪大豆胨液体造就基中置30～35℃造就箱中造就18～24h,取金黄色葡萄球菌.铜绿假单胞菌.大肠埃希菌.枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体造就物1ml参加％无菌氯化钠溶液中,制成10-1 的菌液,依法10倍稀释至10～7,分取各菌悬液1ml注入平皿中,立刻倾泻胰酪大豆胨琼脂造就基20ml,各菌悬液平行制备两个平皿,平皿法造就计数,取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用.取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面造就物,参加沙氏葡萄糖液体造就基中置20～25℃造就箱中造就24～48h,取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体造就物1ml参加％无菌氯化钠溶液中,制成10-1 的菌液,依法10倍稀释至10～7,取菌悬液1ml注入平皿中,立刻倾泻沙氏葡萄糖琼脂造就基25ml,各菌悬液平行制备两个平皿,平皿法造就计数,取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用.取黑曲霉的新颖造就物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上,20-25℃造就5-7天,参加3-5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱.取1ml参加含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,制成10-1的菌液,依法10倍稀释至10～7,取,取菌悬液1ml注入平皿中,立刻倾泻沙氏葡萄糖琼脂造就基25ml,各菌悬液平行制备两个平皿,平皿法造就计数,取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用.3.7需氧菌.霉菌和酵母菌计数办法实用性实验：供试液制备：取供试品10 ml,加至100ml→1:10供试液.实验前提：需氧菌造就温度：30～35℃3～5天造就箱：霉菌和酵母菌造就温度：20～25℃ 5～7天造就箱：3.7.3实验办法：.1实验组：3.7.3.1.1分离取供试液9.9ml,分离铜绿假单胞菌.金黄色葡萄球菌.枯草芽孢杆菌,混匀后取个中1ml注皿,倾泻温度不超出45℃的胰酪大豆胨琼脂造就基20ml,置30～35℃或造就箱中造就不超出3天,计数,每株实验菌平行制备2个平皿.3.7.3.1.2分离取供试液9.9ml,分离白色念珠菌.黑曲霉菌液,混匀后分离取个中1ml注皿,倾泻温度不超出45℃的胰酪大豆胨琼脂造就基20ml,置30～35℃或造就箱中造就不超出5天,计数,每株实验菌平行制备2个平皿.另分离取个中1ml注皿, 倾泻温度不超出45℃的沙氏葡萄糖琼脂造就基20ml,置20～25℃或造就箱中造就不超出5天,计数,每株实验菌平行制备2个平皿. .2菌液对比组：分离取稀释液9.9ml,分离菌液,按实验组操纵,倾泻温度不超出45℃的胰酪大豆胨琼脂造就基和沙氏葡萄糖琼脂造就基,置与实验组雷同前提下造就, 计数.每株实验菌平行制备2个平皿..3供试品对比组：取供试液1ml,倾泻温度不超出45℃的胰酪大豆胨琼脂造就基和沙氏葡萄糖琼脂造就基,置与实验组雷同前提下造就, 计数.每株实验菌平行制备2个平皿.实验成果～2规模内.比值=实验组菌落数～供试品对比组的菌落数*对比组菌落数实验次数：1 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期：实验次数：2 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期：实验次数：3 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期：实验次数：1 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期：实验次数：2 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期实验次数：3 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期3.7.5结论:磨练人：日期：复核人：日期：掌握菌微生物检测办法实用性实验：.1实验办法：3.8.1.1实验组：取供试液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌菌液参加胰酪大豆胨液体造就基中,置30～35℃造就18-24小时, 取上述造就物1ml接种至100ml麦康凯液体造就基中,42～44℃造就24-48小时.取麦康凯液体造就物划线接种于麦康凯琼脂造就基平板上30～35℃造就18-72小时.实验组应发展优越.3.8.1.2阴性对比组：取稀释剂10ml,参加胰酪大豆胨液体造就基中,置30～35℃造就18-24小时,阴性对比应无菌发展.3.8.1.3阳性对比组：取不大于100cfu大肠埃希菌菌液参加胰酪大豆胨液体造就基中,置30～35℃造就18-24小时, 取上述造就物1ml接种至100ml麦康凯液体造就基中,42～44℃造就24-48小时.取麦康凯液体造就物划线接种于麦康凯琼脂造就基平板上30～35℃造就18-72小时.阳性对比组应发展优越.实验成果：实验次数：1 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期：实验次数：2 供试品批号:磨练人：日期：复核人：日期：实验次数：3 供试品批号:结论：磨练人：日期：复核人：日期：4. 办法剖断：本品按《中国药典》2015年版（1105）.（1106）非无菌产品微生物限度检讨项下：“微生物计数法”“掌握菌检测法”进行实验.细菌数测定可用.霉菌.酵母菌数测定可用.掌握菌,可用.5.再验证周期：当产品的微生物限度检讨办法转变.产品组分.工艺转变时,应进行再实验. 6.参考文献：中国药典2015版7．成果评价及结论：验证尺度,该实用性实验办法接收 .审核人/日期：同意人/日期：。
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微生物限度检验方法验证方案1.适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。
2.目的通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。
3.职责项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。
验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。
QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。
QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。
QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。
质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。
4.内容4.1.概述通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。
根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。
.验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
4.2.1.验证用菌株及菌种要求大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。
大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。
验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
4.2.2.验证菌菌液制备4.2.2.1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，35～37℃培养18～24小时。
取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6~10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。
4.2.2.2.白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6~10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。
4.2.2.3.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，吸至无菌试管内，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-6，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
4.2.3. 供试液的制备4.2.3.1.无抑菌活性的供试品供试液的制备◆稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液◆液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加入90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）。
◆固体、半固体、粘稠性供试品供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。
4.2.3.2.具有抑菌活性的供试品供试液的制备当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：◆培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。
每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。
计算每1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时可加大增菌液的用量。
◆离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
◆薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定其菌落数。
◆中和法：选取适宜的中和剂如磺胺类药物加入适当的对氨基苯甲酸，含重金属的药物在培养基内加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸，洗必泰制剂加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），卤素中加入硫代硫酸钠（0.1%）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性后测定。
4.2.4. 菌液组 测定所加的试验菌数。
采用平皿法，取试验用的1ml 菌液（约50～100cfu ）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
4.2.5.试验组4.2.5.1.平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml 供试液和50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
4.2.5.2.培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级1ml 供试液分别注入N 个平皿中，每个平皿再注入50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
4.2.5.3薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。
至少要一张膜。
4.2.5.4.离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml 液体，并用稀释剂洗涤管底，将洗涤液与1ml 液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
4.2.6. 供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）。
4.2.7.稀释剂对照组若供试液需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法等处理时，应增加稀释剂对照组，用稀释剂代替供试品，加入试验菌，使最终浓度为每1ml 供试液含50～100cfu ，按试验组的供试液制备方法和计数方法计数。
4.2.8.回收率计算4.2.8.1.试验组回收率计算4.2.8.2. 稀释剂对照组回收率计算计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
4.2.8.结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组试验组的菌回收率＝ 试验组的菌回收率—供试品对照组平均菌落数×100%菌液组的平均菌落数 试验组的菌回收率＝ 稀释剂对照组平均菌落数×100%菌液组的平均菌落数的平均菌落数的百分率）≥70%。
若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。
照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率大于70%。
4.3. 控制菌检验方法验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
4.3.1.验证用菌株大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
4.3.2.菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10～100cfu的菌悬液。
4.3.3.阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。
方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。
阴性对照菌不得检出。
4.3.4.试验组4.3.4.1.常规法◆大肠埃希菌取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，取此培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。
◆大肠菌群取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g 或1ml 、0.1g或0.1ml、含供试品0.001g或0.001ml的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，按《微生物限度检查SOP》大肠菌群项下规定检查。
◆沙门菌取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加入沙门菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。
按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。
◆铜绿假单胞菌取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。
按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。
◆金黄色葡萄球菌取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。
按《微生物限度检查SOP》金黄色葡萄球菌项下规定检查。