园艺学进展

果树分子生物学发展综述

摘要：本文总结了园艺产业中适合不同果树病毒的检测方法、真菌病毒的简介、下一代测序技术的应用、Micro RNA的简介。

关键词：果树病毒检测真菌病毒高通量测序技术

引言

果树组织中病毒含量一般较低，难以检测，这对病毒检测方法有较高的要求。与传统的果树病毒检测方法相比，病毒核酸检测方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优势，因而成为果树病毒检测发展的方向，特别是以PCR技术为基础的检测方法发展迅速。由于实时PCR、多重PCR和NASBA技术进一步提高了检测效率和检测速度，因此发展前景较好，特别是利用荧光实时PCR和NASBA同时检测多种病毒是发展的主要方向。

近年来由发现真菌病毒导致病原菌低毒力，对植物病原真菌dsRNA病毒研究较多，研究最深入的真菌病毒是产黄青霉的病毒，真菌病毒的侵染可使食用真菌遭受灭顶之灾。如双孢蘑菇的枯死是一种危害性很大的IaFranceDisease引起的病毒病害，表现为双孢蘑菇畸型，菌丝溶化，不再产生蘑菇而减产。病毒的侵染也会造成香菇菌丝生长缓慢，略带黄色，袋装菌块上形成秃斑，有时产生不正常的子实体和孢子。然而某些感染病毒的植物病原菌表现出低毒力，对植物的致病性降低。如感染了杆状病毒的Botrytiscinerea对水果和花卉的侵染力明显减低，感染病毒的栗疫菌低毒力菌株等已成为生物防治病原真菌的重要手段，使意大利的栗树林得以恢复，我国在栗疫菌病毒的研究也取得一定成果。研究低毒力相关的dsRNA与其他真菌病毒dsRNA的关系，将对真菌病毒dsRNA 的基础研究以及如何调控病原真菌dsRNA对寄主的毒力提供依据。欧美等地用低毒力菌株进行生物防治取得了明显的效果，给国内果树病毒防治提供了一种生防的新思路。

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。同时，高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种测序技术：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序（DNA nanoball sequencing）。在植物研究领域，因为高通量测序技术的出现，使得基因组测序、转录组测序、microRNAs探查等不再是难事，极大地推动了植物分子生物学研究进程。

在多细胞生物的基因组中都存在一类非编码RNA基因,能够产生长度约为22个核苷酸的小分子RNA ,称为micro RNA (miRNA) ,具有调节其他基因表达活性的功能。miRNA的发现,为我们理解复杂的基因调节网络开辟了新的空间。

一、果树病毒检测技术

1.1.利用PCR技术检测果树病毒的研究进展

PCR技术可以快速地对病毒进行鉴定，其灵敏度高于血清学方法，而且也可以灵敏地检测维管束病毒。PCR引物的合成及长期保存也比较方便。利用PCR技术，对多数植物病毒都可以稳定地进行检测，而在果树病毒的检测中，有较多检测结果受季节影响的报道。为了提高检测的稳定性和检测效率，免疫捕获

PCR(ImmunocapturePCR,IC—PC）、印迹捕获PCR(Print—capture PCR，PC—PCR)、巢式PCR(Nested-PCR)、PCR-ELISA，实时PCR(Real．Time PCR)等一些新的PCR技术已被应用于果树病毒的检测中。

IC—PCR利用抗血清捕获病毒粒子后，再进行PCR扩增，解决了病毒含量低和核酸纯度低影响扩增的问题。尽管IC．PCR需要抗血清，且需要免疫捕获步骤，但对于草莓、樱桃等难以分离优质核酸树种的病毒检测有独特的优势。在检测SMYEV的研究中，常规PCR无扩增产物，而IC．PCR对不同的引物都可以很好的扩增。由于香蕉基因组中整合有香蕉线条病毒Banana steak virus，BSⅥ的部分核酸序列，因此，利用IC．PCR检测香蕉中的BSV可以避免假阳性。PC—PCR

是利用蛋白混合物或抗血清在滤纸或膜上捕获组织中的病毒后再进行PCR反应。操作简单，不用研碎组织，避免了组织中PCR抑制物质的释放，捕获后的膜可以储存或邮寄，应用方便该方法目前应用还相对较少，有待于应用于更多的果树病毒检测中。巢式PCR是利用两对相互嵌套的引物进行两次扩增，即一般先利用低专化性的引物(如简并引物)进行扩增，取少量扩增产物后再利用高专化性的引物进行扩增。巢式PCR提高了检测灵敏度并降低了核酸中PCR抑制物质的影响，不需另外的仪器及试剂，适合普通的实验室应用；但巢式PCR操作较繁琐，容易污染。PCR—ELISA也称作PCR微量板杂交CPCR(microplate hybridization)技术，是通过一定的方法将PCR产物固定于微孔板中，与特异性探针进行分子杂交，再利用酶联免疫技术来检测杂交信号的新型检测技术。PCR—ELISA具有灵敏度高、安全、客观读取数据等优点，目前已有商业化的试剂盒利于应用。实时PCR是一种最新的PCR技术，利用荧光探针来监测PCR反应的进行，可以随时了解反应的进行并可以对病毒进行定量，反应快速灵敏，避免了电泳染色剂对人的毒害。

1.2.利用分子杂交技术检测果树病毒

分子杂交是将少量变性的核酸固定在固体支持膜上，用专一性检测互补核酸序列的标记探针与样品进行杂交，再通过放射自显影或酶标颜色反应进行检测。分子杂交的关键是制备特异性强、灵敏度高、具有高比活的探针，目前应用较多的是地高辛和生物素等非放射性标记探针。由于RNA／RNA结合比DNA／RNA 结合更加稳定，cRNA探针优于cDNA探针。

1.3.利用dSRNA技术检测果树病毒

大多数果树病毒为RNA病毒，这些病毒在复制时会产生dsRNA，而每一种RNA病毒都在寄主体内有特异的dsRNA，不同病毒的dsRNA分子量不同，因而可利用电泳进行检测。提取dsRN A操作简单，不需要特殊的大型仪器，一般实验室即可进行，其基本原理是将含有去垢剂、抗氧化剂及螯合剂的缓冲液和有机溶剂与充破碎的植物组织混匀，在适当的乙醇浓度下dsRNA与纤维素吸附，通过柱层