石蜡切片技术

石蜡切片技术

病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对我们研究生来说还可以提供教学、科研的资料。

病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。

第一节组织制片的概述

组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。

第二节制片的种类

1、组织切片法

任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。在切成薄片以前必须设发使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。冰冻组织切片发是直接利用快速冷冻法进行切片。

2、组织非切片法

不用切片机，不经过切片手续而制成组织切片的方法，包括整体封藏法、浮片法、压碎法和组织直接印片法。这些方法操作简单而快，可根据制片的需要进行选择使用。

石蜡切片技术

石蜡切片法组织切片的主要程序：取材→组织固定→固定后处理→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→粘片→脱蜡→水化→水洗→常规或特殊染色→脱水→透明→树胶封片。

一、取材

取材(DrawMaterials)是根据实验目的及临床活检、尸解组织的病变程度而合理取得组织材料。为了制作优质的切片，取材时组织愈新鲜愈好，并应及时固定。

（一）病理标本的来源分类：

有临床活检、尸体解剖、实验动物、培养细胞

主要病理标本大致可分类如下：

1、手术标本

2、内镜取材标本

3、穿刺取材标本

4、细胞学标本可分为：痰、尿、阴道分泌物、胸水腹水、穿刺细胞学标本、内镜刷取标本、其它如脑脊液、关节液、前列腺挤排物、十二指肠引流物、胆汁等。

(二)取材的一般原则

1、认真观察，取准标本病变部位，切勿漏取。

2、要能全面反映出器官有无病变，显示病变全貌(最大面积)，包括肿瘤转移部位、切缘等。

3、根据临床或肉眼所见及病史提示对病变组织多取材，主要病变与相关组织多取材，特殊病变要尽量多取材。

4、若取材大小受限，应尽量取包含病变周边相对正常组织。

5、应避免选取凝血块、坏死组织及粘液成分。

6、要全面描述病变状况，由表及里，测重量、部位、体积等。

（三）取材方法

（四）取材注意事项

1、注意研究目的：培养？定量？对比观察？临床诊断？

2、选择恰当的取材部位切取有明显病变或可疑病变的组织。必要时选取病变与正常组织交界处。

3、避免使组织受挤压取材刀刃要锋利，避免钝刃、钝钳或镊等器械过度挤压组

织。4、取材大小应合宜取材组织块大小一般以0.5cm×0.5cm×0．2cm或lcm×lcm×0.3cm，最厚勿超过0.5cm。

5、取材数量：不同的标本取材的组织块多少不同，原则是凡可疑处均应取材，不要遗漏。

6、选择切面方向所取组织应包括各脏器的重要结构或全层。

7、做好组织块标记

8、手术标本应全部送检

9、小标本的处理方法：常常用易透水的薄纸包好，在取材时将标本染上伊红液，以免包埋过程中遗失。

10、避免交叉污染

(五)临床病理取材注意事项

1、检查申请单的姓名是否与标本标注的姓名相符

2、检查申请单所列标本是否与实际标本吻合。

3、检查申请单所列标本件数是否与实际标本件数吻合。

二、组织固定

固定是利用固定液（常用福尔马林和酒精）把组织细胞的固有形态结构保存下来，以便观察研究之用，固定液同时具有硬化细胞组织的作用，使制片便于进行。

（一）固定的作用：

1、保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败，以及细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。

2、保持细胞内特殊的成分如蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。

3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，而产生不同的折射率，造成光学上的差异，同时固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，以便染色后易于区别和观察不同组织成分。

4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬义，便于制片。

（二）原理：使组织及细胞内蛋白凝固；使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质。

（三）方法：浸泡、灌注（局部灌注、全身灌注）、蒸汽熏蒸

（四）固定时间:

常规组织病理学: 可长时间固定

细胞病理学：可长时间固定

细胞化学：不宜过长，约1小时为宜

（五）固定注意事项

1. 固定液有毒性，注意自身防护

2. 及时，尽可能新鲜。应在组织取下后立即或尽快放入适当固定液中。

3. 超微结构观察：低温固定

4. 注意不同研究目的对固定液的特殊需要

细胞化学

超微结构

细胞涂片巴氏染色

5. 固定液用量：足，必要时及时更换。一般应为组织块总体积的4~5倍，也可达15~20倍。

（六）常用的固定液：

甲醛、乙醇、醋酸、氯化汞、苦味酸、丙酮、重铬酸钾、乙醇-甲醛液、AAF液、、Bouin氏液、Garnay氏液、甲醛-生理盐水等。

三、固定后处理：

组织在固定后一定要把渗透到里面的固定液及时洗去，有利于脱水直至切片和染色，并防止染色中甲醛色素的产生。

要充分洗涤，固定时间越长，洗涤时间也应相应增加。

四、脱水：

脱水是利用脱水剂置换及驱除组织中的水分的过程，以利于透明和浸蜡。组织经固定和水洗后含有大量水分，但水与苯不相溶，所以组织在透明前必须经过脱水这一环节，以利于透明剂和石蜡渗入。普遍使用的脱水剂是乙醇、丙酮。由于脱水剂穿透组织的速度很快，常导致组织过度收缩及变脆，因此必须从低浓度开始，依次递增，直至纯脱水剂，最后组织内部的水分为高浓度脱水剂所取代。故称为梯度脱水。

一般大小约为1.5cm×l.8cm×0.2cm的组织，其脱水步骤和时间如下：

70％乙醇1～2h

80％乙醇2～4h

90％乙醇2～4h

95％乙醇2～4h

无水乙醇2～4h

脱水注意事项：

1.组织脱水必须由低浓度向高浓度逐步过渡。

2.组织脱水要彻底干净是影响制片质量的一个重要环节。

3.脱水时间要适度，时间短，脱水不尽；时间过长，促使组织收缩变硬。脱水时间要根据组织块大小、厚度、脱水剂的新旧程度（纯度）等适当增减调节。

4.脱水必须在有盖瓶子内进行，尤其是高浓度乙醇很易吸收空气中的水分。

5.组织块在换入高一级浓度乙醇时，可先在吸水纸上吸干以免把水分带入更高浓度的乙醇中。