垂直电泳仪
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7.样品处理：在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入上样buffer，在100℃加热3-5分钟以使蛋白质变性。
8.加样：在外水槽加电泳缓冲液至槽体的一半位置。放正槽体，继续加注缓冲液，避免产生气泡，使内槽的水位均超过凹形板的缺口但低于方形板的上沿。用微量加样器或普通加样枪在梳井内按预定顺序加样，加样量通常为10～25μl。
三、 试剂与器材：
试剂:
(1)人IgG免疫兔的抗血清；
(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；
(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；
(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；
另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhanced chemiluminescenceECI。)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。
5．丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用。但在形成凝胶后则无毒。操作时应戴橡胶或塑料手套，尽量避免接触皮肤，并注意实验后洗手。
电转印：
正极（在下方，红色电极）两层滤纸NC膜或PVDF膜PAGE
胶两层滤纸负极（在上方，黑色电极）
定电压：10V, 40~60Min
注意：NC膜要放在正极，要用手或滚子压走气泡。
(6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液(1：500)中，37℃轻摇2 h。
(7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10 min。
(8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。
(9)加底物溶液反应2～10 rain，至抗原区带显色清楚为止。
(10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
四、操作方法：
1、SDS-PAGE
将待检测的抗原粗提取液、纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量蛋白质等用SDS-PAGE分离。
2、转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上
(1)准备转移缓冲液。
(2)切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜，并用转移缓冲液浸湿，放置15 min直到没有气泡。
(3)切割8张普通滤纸，其大小与胶尺寸大小相符，并将其浸泡在有转移缓冲液的培养皿中(与硝酸纤维素薄膜分开浸泡)。
胶的保存
用30﹪甲醇，7﹪乙酸，2-5﹪甘油混合液振荡处理1小时。
注意
1．清洗玻璃板。玻璃板应清洗干净，玻璃表面的油污会造成分离胶与浓缩胶界面的不平整。经用去污剂洗涤后的玻璃板先用蒸馏水冲洗，再用纱布蘸乙醇擦拭玻璃表面。
2．分离胶浓度的选择。低浓度胶对大分子量蛋白质分离效果好：高浓度胶对小分子量蛋白质分离效果好。
(4)电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。
(5)打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：
①4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；
②用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；
③放上硝酸纤维素膜；
④另4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；
(6)小心地合上转移槽的盖板；
(7)插入电极，注意正负极方向(硝酸纤维素膜面向阳极)，打开电泳仪开关，调至胶的面积(cm2)×O．8 mA，1．5～2 h。
D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；
(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
器材:
(1)半干转移槽；
(2)电泳仪电源：直流稳压，500 V，150 mA。
1．如上所述，将电泳好的凝胶板取出。手戴橡胶手套将凝胶小心移入染色器皿中。
2．在染色皿中加入100ml考马斯亮蓝染液（含0﹒25﹪考马氏亮蓝R-250，45﹪甲醇，10﹪冰醋酸的水溶液），加盖，在摇床上染色2小时。
3．将染液倒回贮存瓶，反复使用。在染色皿中加入100ml脱色液（10﹪冰醋酸，45﹪甲醇），振荡脱色3小时，也可反复更换脱色液，缩短时间。
(10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhanced chemiluminescenceECI。)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。
(5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10 min。
WEALTEC垂直电泳仪操作流程
一、灌胶
1.把制胶器放在平稳的台面上。
2.保持制胶器干燥，抬起两侧的羽状开关放开卡门，平放，放进橡胶垫圈并紧扣。先把厚玻璃平板放入，再放两侧的垫片，后放入带凹型的玻璃平板。
3.紧紧合上卡门，同时按压两侧的羽状开关听到“咔嚓”声音。
4.倒分离胶：将配好的分离胶溶液用加样枪缓慢加入制胶玻板之间,直至液面达到卡门边框下缘线处。小心用加样枪将去离子水沿水平方向加入制胶板中的分离胶液面上，以防止胶液蒸发并保证胶面平整。聚合大约需要30mins。
转印完毕，将NC膜取出，室温干燥30-60min，浸入1%BSA的PBS液中4℃过夜封闭。
2）酶免疫染色
①取出封闭液中NC膜，含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次。
加入1：400的抗CD59McAb10ml，37℃1h。
②含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次
5.倒浓缩胶：分离胶聚合后，倒掉去离子水，用滤纸吸去残液。在玻板中加满浓缩胶溶液，轻轻地插入合适的梳子，梳子的厚面向实验者，避免产生气泡。
30分钟后，除去梳子，抬起两侧的羽状开关放开卡门，拿出带胶的制胶玻板。
6.安装电泳槽：按压电泳槽中央夹具的开关使卡门松开，将玻璃夹板放入槽内。注意，两玻璃夹板的凹玻板均应与电泳槽内芯接触。如果每次只电泳一块胶，另一套玻璃夹板必须用提供的有机玻璃板代替。
③加入1：4000的羊抗鼠IgG10ml，37℃1h。
④含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次
⑤加入含0.06%DAB和H2O2的底物液,显色20-30min。
观察条带情况，判断结果。
一、实验目的：
免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：
蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
(8)转移结束后打开盖板取出硝酸纤维素薄膜。
3、免疫印迹膜的处理
(1)用PBS缓冲液洗膜5～10 rain。
(2)将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻摇(37℃)60 rain。
(3)用PBS缓冲液洗膜3次，每次10 rain。
(4)将膜置于第一抗体溶液(小牛血清免疫兔的抗血清，1：10)中，置摇床上轻摇，37℃摇动2 h或4℃过夜。
9.电泳：盖好上盖，在100—150V的电压下电1—2小时，一般浓缩胶电压80V20~30Min，分离胶120V80Min，到样品指示剂到达玻璃板的下缘，关掉电源。取下玻璃夹板。用刀片或薄板将胶板玻璃橇开，用单面剃刀片将分离胶切掉，将凝胶板的左上角切掉一小角以标记样品顺序。
附录
染色与脱色（考马斯亮蓝法）
(5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10 min。
(6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔Igቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ溶液(1：500)中，37℃轻摇2 h。
(7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10 min。
(8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。
(9)加底物溶液反应2～10 rain，至抗原区带显色清楚为止。
(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；
(6)底物溶液：
A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；
B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；
C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；
3．TEMED的加入量。TEMED是促进丙烯酰胺聚合的加速剂。加速效果随试剂保存时间而变化。对于陈旧试剂，可适当多加。事实上，配制分离胶时每块胶板按2滴加入，效果也不错。
4．电极缓冲液的配制。电极缓冲液的用量大、占体积、配制麻烦。如果经常跑胶，可考虑配制5X浓度的浓缩液。方法如下：将144g甘氨酸和30﹒2gTris溶于1升蒸馏水中。使用时稀释5倍。
8.加样：在外水槽加电泳缓冲液至槽体的一半位置。放正槽体，继续加注缓冲液，避免产生气泡，使内槽的水位均超过凹形板的缺口但低于方形板的上沿。用微量加样器或普通加样枪在梳井内按预定顺序加样，加样量通常为10～25μl。
三、 试剂与器材：
试剂:
(1)人IgG免疫兔的抗血清；
(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；
(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；
(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；
另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhanced chemiluminescenceECI。)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。
5．丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用。但在形成凝胶后则无毒。操作时应戴橡胶或塑料手套，尽量避免接触皮肤，并注意实验后洗手。
电转印：
正极（在下方，红色电极）两层滤纸NC膜或PVDF膜PAGE
胶两层滤纸负极（在上方，黑色电极）
定电压：10V, 40~60Min
注意：NC膜要放在正极，要用手或滚子压走气泡。
(6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液(1：500)中，37℃轻摇2 h。
(7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10 min。
(8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。
(9)加底物溶液反应2～10 rain，至抗原区带显色清楚为止。
(10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
四、操作方法：
1、SDS-PAGE
将待检测的抗原粗提取液、纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量蛋白质等用SDS-PAGE分离。
2、转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上
(1)准备转移缓冲液。
(2)切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜，并用转移缓冲液浸湿，放置15 min直到没有气泡。
(3)切割8张普通滤纸，其大小与胶尺寸大小相符，并将其浸泡在有转移缓冲液的培养皿中(与硝酸纤维素薄膜分开浸泡)。
胶的保存
用30﹪甲醇，7﹪乙酸，2-5﹪甘油混合液振荡处理1小时。
注意
1．清洗玻璃板。玻璃板应清洗干净，玻璃表面的油污会造成分离胶与浓缩胶界面的不平整。经用去污剂洗涤后的玻璃板先用蒸馏水冲洗，再用纱布蘸乙醇擦拭玻璃表面。
2．分离胶浓度的选择。低浓度胶对大分子量蛋白质分离效果好：高浓度胶对小分子量蛋白质分离效果好。
(4)电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。
(5)打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：
①4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；
②用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；
③放上硝酸纤维素膜；
④另4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；
(6)小心地合上转移槽的盖板；
(7)插入电极，注意正负极方向(硝酸纤维素膜面向阳极)，打开电泳仪开关，调至胶的面积(cm2)×O．8 mA，1．5～2 h。
D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；
(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
器材:
(1)半干转移槽；
(2)电泳仪电源：直流稳压，500 V，150 mA。
1．如上所述，将电泳好的凝胶板取出。手戴橡胶手套将凝胶小心移入染色器皿中。
2．在染色皿中加入100ml考马斯亮蓝染液（含0﹒25﹪考马氏亮蓝R-250，45﹪甲醇，10﹪冰醋酸的水溶液），加盖，在摇床上染色2小时。
3．将染液倒回贮存瓶，反复使用。在染色皿中加入100ml脱色液（10﹪冰醋酸，45﹪甲醇），振荡脱色3小时，也可反复更换脱色液，缩短时间。
(10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhanced chemiluminescenceECI。)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。
(5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10 min。
WEALTEC垂直电泳仪操作流程
一、灌胶
1.把制胶器放在平稳的台面上。
2.保持制胶器干燥，抬起两侧的羽状开关放开卡门，平放，放进橡胶垫圈并紧扣。先把厚玻璃平板放入，再放两侧的垫片，后放入带凹型的玻璃平板。
3.紧紧合上卡门，同时按压两侧的羽状开关听到“咔嚓”声音。
4.倒分离胶：将配好的分离胶溶液用加样枪缓慢加入制胶玻板之间,直至液面达到卡门边框下缘线处。小心用加样枪将去离子水沿水平方向加入制胶板中的分离胶液面上，以防止胶液蒸发并保证胶面平整。聚合大约需要30mins。
转印完毕，将NC膜取出，室温干燥30-60min，浸入1%BSA的PBS液中4℃过夜封闭。
2）酶免疫染色
①取出封闭液中NC膜，含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次。
加入1：400的抗CD59McAb10ml，37℃1h。
②含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次
5.倒浓缩胶：分离胶聚合后，倒掉去离子水，用滤纸吸去残液。在玻板中加满浓缩胶溶液，轻轻地插入合适的梳子，梳子的厚面向实验者，避免产生气泡。
30分钟后，除去梳子，抬起两侧的羽状开关放开卡门，拿出带胶的制胶玻板。
6.安装电泳槽：按压电泳槽中央夹具的开关使卡门松开，将玻璃夹板放入槽内。注意，两玻璃夹板的凹玻板均应与电泳槽内芯接触。如果每次只电泳一块胶，另一套玻璃夹板必须用提供的有机玻璃板代替。
③加入1：4000的羊抗鼠IgG10ml，37℃1h。
④含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次
⑤加入含0.06%DAB和H2O2的底物液,显色20-30min。
观察条带情况，判断结果。
一、实验目的：
免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：
蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
(8)转移结束后打开盖板取出硝酸纤维素薄膜。
3、免疫印迹膜的处理
(1)用PBS缓冲液洗膜5～10 rain。
(2)将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻摇(37℃)60 rain。
(3)用PBS缓冲液洗膜3次，每次10 rain。
(4)将膜置于第一抗体溶液(小牛血清免疫兔的抗血清，1：10)中，置摇床上轻摇，37℃摇动2 h或4℃过夜。
9.电泳：盖好上盖，在100—150V的电压下电1—2小时，一般浓缩胶电压80V20~30Min，分离胶120V80Min，到样品指示剂到达玻璃板的下缘，关掉电源。取下玻璃夹板。用刀片或薄板将胶板玻璃橇开，用单面剃刀片将分离胶切掉，将凝胶板的左上角切掉一小角以标记样品顺序。
附录
染色与脱色（考马斯亮蓝法）
(5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10 min。
(6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔Igቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ溶液(1：500)中，37℃轻摇2 h。
(7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10 min。
(8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。
(9)加底物溶液反应2～10 rain，至抗原区带显色清楚为止。
(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；
(6)底物溶液：
A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；
B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；
C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；
3．TEMED的加入量。TEMED是促进丙烯酰胺聚合的加速剂。加速效果随试剂保存时间而变化。对于陈旧试剂，可适当多加。事实上，配制分离胶时每块胶板按2滴加入，效果也不错。
4．电极缓冲液的配制。电极缓冲液的用量大、占体积、配制麻烦。如果经常跑胶，可考虑配制5X浓度的浓缩液。方法如下：将144g甘氨酸和30﹒2gTris溶于1升蒸馏水中。使用时稀释5倍。