猫病毒性鼻气管炎PCR检测方法的建立与应用
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（ ． 国 药 品 生 物 制 品检 定 所 ， 京 东 城 １０ ５ ；２ 中 国 农 业 大 学 动 物 医 学 院 ， 京 海 淀 １０ ９ ） １中 北 ０００ ． 北 ０ １ ３ 中 图 分 类 号 ：８ ８ ２ ３ ￥ ５． ９ 文 献 标 识 码 ： Ｂ 文章 编 号 ：５ ９６０ （０ １０ —０ ５０ ０ ２—０ ５ ２ １ ） ５０ ２—２
．
猫 病毒 性 鼻气 管炎 （ Ｒ） 称 猫 疱 疹 病 毒 Ｉ型 Ｆ 又
Ｆ ＿Ｔ 基 因部分 片段的 引物 ： １５ Ｃ Ｔ Ｇ — ＨＶ １ Ｋ Ｐ ＧＣ Ｔ ＡＧ －
ＧＡＣＡＧＣＡＴＡＡ 一 ． ＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡ ３ Ｐ２ ５ 一
（ ＨＶ １ 可 引起猫 的上 呼 吸 道感 染 ， 一种 猫 的 常 Ｆ 一） 是 见 的急性 、 高度接 触性 上 呼 吸道疾 病口 ］ 。病 猫精 神 沉郁 ， 喷 嚏 ， 欲下 降 ， 打 食 结膜 炎 ， 浆液 性 的眼鼻 分泌 物， 体温 升 高 ， 部 的气管 咳 嗽＿ 。慢性 感染 病 例舌 深 ３ ］ 头 和上颔 出现溃 疡 。Ｆ ＨＶ一 １只感 染猫 及猫 科 动 物 ， 主要 侵 害 幼 猫 ， 病 率 达 １ ０ ［ ， 亡 率 约 为 发 ０ ４ 死 ］ ５ ＿ Ｏ ５ ］ 若 怀 孕猫 感染 ， 造成 流产 ｌ 。 可 ＿ ６ ］
仿 ： 异戊 醇 （ 积 比为 ２ ２ １ 除蛋 白质 。无 水 体 ５： ４： ） 乙醇 和 ３ｍｏ／ ｌＬ醋 酸钾 沉淀 ＤＮＡ。离 心弃上 清 ， 干 燥后 加人 灭菌 双蒸 水制 成样 品待 用 。 １ ４ Ｐ Ｒ扩 增 ２ Ｌ反 应 体 系 ： 品 ２ Ｌ， 下 ． Ｃ Ｏ 样 上 游 弓 物 １ Ｌ， Ｎ ｓ２ Ｌ， Ｏ×Ｂ ｆ ｒ Ｍｇ １ ２ Ｉ ｄ ＴＰ １ ｕｆ （ Ｃ ２ ｅ Ｌ Ｔ ｑＤ ， ａ ＮＡ 聚合 酶 ０ ３ Ｌ， 菌 双 蒸 水 加 至 ２ ． 灭 ０ Ｌ 。Ｐ Ｒ程 序 ： ４ ３ｍｉ ，９ ℃ １ｍｉ ，５ ℃ ４ Ｓ Ｃ ９℃ ｎ ４ ｎ ２ ５，
毒 （Ｐ 、 Ｆ Ｖ） 猫传 染 性腹 膜 炎 病 毒 （ Ｉ Ｖ） 均 由本 实 ＦＰ ， 验 室 分 离 保 存 。试 剂 Ｔ ｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 ， ｒ ｅ－ ａ Ｍａｋ ｒ
ＤＬ ２０ ０ Ｐ ＡＳ — 一 ０ ， Ｅ Ｙ Ｔ１载体 和 Ｍａ ｃ ｌＴ１菌 液 （ ｒｈ — 北
扩增 。 １ ６ 特 异 性 试 验 从 Ｆ ． ＨＶ １ Ｆ Ｖ、 Ｉ Ｖ 的病 毒 － 、 Ｐ ＦＰ 保 存液 中提取 病 毒 ＤＮＡ， 入 该 Ｐ Ｒ 反 应 体 系进 加 Ｃ 行 扩增 ， 测该 方法 的特 异性 。 检
１１ 材 料 ．
猫 疱 疹 病 毒 工型 （ ＨＶ－ ） 猫 细 小 病 Ｆ １、
Ｃ ｉｅｅ ｏ ｒａ ｆ ｔｒ ａｙＭｅ ｉｎ ｈｎ ｓ ｕｎ ｌ ｅｉ ｒ ｄｃ ｅ Ｊ ｏ Ｖｅ ｎ ｉ
中 国兽 医杂 志 ２ １ 年 （ ４ ０ １ 第 ７卷 ） ５期 第
２５
Baidu Nhomakorabea
猫 病 毒 性 鼻气 管 炎 Ｐ Ｒ检 测 方法 的建 立 与应 用 Ｃ
屈 哲 。 ，徐 镔 蕊 ，睢 艳 平 ，王 勇 杜 艳 。 ，
收 稿 日期 ：２ ０ —９２ ０ ７０—６ 作 者 简 介 ： 哲 （９ ２） 女 ， 习 研 究 员 ， 士 ， 事 药 品 科 研 工 屈 １８ 一 ， 实 硕 从
。
Ｇ － 由北京优 博基 因科 技 有 限公 司合 成 。 Ａ ３， １ ３ 提 取 ＤＮＡ ． 含有 病毒 的分 泌物溶 于灭 菌生 理
盐水 ， 心 弃 上 层 液 体 后 加 入 裂 解 液 和 蛋 白酶 Ｋ 离
５ ℃水浴 消 化 ２ ｈ以上 ， Ｔｒ 饱 和 酚 和 酚 ：氯 ６ 用 ｉ ｓ
京全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司 ） ｄ ， ＮＴＰ ， ｕｆｒ ｓ Ｂ ｆｅ （ Ｃ ， Ｍｇ １ 随机 引物 （ 京优 博基 因科 技 有 限公 司提 ） 北 供 合成 ） 。 １ ２ 引 物 根 据 Ｇｅ Ｂ ｎ 中注 册 的 Ｆ ． ｎ ａｋ ＨＶ一－ １ＴＫ 基 因 ， 助 Ｐ ｉ ｒ Ｐ ｅ ｅ５ 借 ｒ ｍｅ ｒｍｉｒ．０软 件 ， 计 针 对 设
多次 发现 临床 可 疑病例 。但兽 医 临床还 只依 靠传 统 的诊 断方 法 ， 断 结果 不准 确 ， 诊 实验 室诊 断也 主要 依
靠病 毒分 离 和血 清学方 法 ［ ， 程费 时 、 ８过 ］ 费力 。而聚
合 酶链 式 反应 （ ｏｙ ｒｓ ｈ ｉ ｅｃｉｎ Ｐ Ｒ） ｐ ｌｍｅａｅｃ ａｎ ｒａ ｔ ， Ｃ 具 ｏ 有 敏感 、 异 、 特 快速 的优 点 ， ］ 特异 性 Ｐ Ｒ检 测方 法 Ｃ 的建立 ， 预 防 ， 对 治疗及 根 除 Ｆ ＨＶ－ １有重 大 意义 。
１ 材 料 与 方 法
后 ，取 ３ Ｌ Ｐ Ｒ产 物 用 １ ０ 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 Ｃ ．
泳检测 。
１ ５ 敏感 性试 验 从 眼分泌 物 中提取 的病毒 ＤＮＡ ． 在紫 外 分 光 光 度 计 上 测 定 浓 度 ， Ｏ Ｌ 体 系 中 含 ２ ＤＮＡ 量约 为 ３ ｇ 按 １ 至 １ 作 １ ， Ｏ ０ Ｏ倍 连 续 稀 释 ，再作 为 模 板 加入 该 Ｐ Ｒ反 应 体 系 中进 行 Ｐ Ｒ Ｃ Ｃ
７ ℃４ ｓ ３ ２ ５ ， ０个 循 环后 ７ ℃作用 １ ｎ ２ ０ｍｉ。反应 结 束
猫 鼻气 管炎 病 毒 （ Ｒ 是 １ ５ Ｆ Ｖ） ９ ８年 Ｃ ａ ｄ ｌ等 ｒｎ ｅｌ 首次 从美 国分 离 ［ 。随后 相继发 现 于加 拿大 、 国、 ７ ］ 英
荷兰 等地 。 目前 ， 国 Ｆ 我 ＨＶ一 病 率 呈 上 升 趋 势 ， １发
．
猫 病毒 性 鼻气 管炎 （ Ｒ） 称 猫 疱 疹 病 毒 Ｉ型 Ｆ 又
Ｆ ＿Ｔ 基 因部分 片段的 引物 ： １５ Ｃ Ｔ Ｇ — ＨＶ １ Ｋ Ｐ ＧＣ Ｔ ＡＧ －
ＧＡＣＡＧＣＡＴＡＡ 一 ． ＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡ ３ Ｐ２ ５ 一
（ ＨＶ １ 可 引起猫 的上 呼 吸 道感 染 ， 一种 猫 的 常 Ｆ 一） 是 见 的急性 、 高度接 触性 上 呼 吸道疾 病口 ］ 。病 猫精 神 沉郁 ， 喷 嚏 ， 欲下 降 ， 打 食 结膜 炎 ， 浆液 性 的眼鼻 分泌 物， 体温 升 高 ， 部 的气管 咳 嗽＿ 。慢性 感染 病 例舌 深 ３ ］ 头 和上颔 出现溃 疡 。Ｆ ＨＶ一 １只感 染猫 及猫 科 动 物 ， 主要 侵 害 幼 猫 ， 病 率 达 １ ０ ［ ， 亡 率 约 为 发 ０ ４ 死 ］ ５ ＿ Ｏ ５ ］ 若 怀 孕猫 感染 ， 造成 流产 ｌ 。 可 ＿ ６ ］
仿 ： 异戊 醇 （ 积 比为 ２ ２ １ 除蛋 白质 。无 水 体 ５： ４： ） 乙醇 和 ３ｍｏ／ ｌＬ醋 酸钾 沉淀 ＤＮＡ。离 心弃上 清 ， 干 燥后 加人 灭菌 双蒸 水制 成样 品待 用 。 １ ４ Ｐ Ｒ扩 增 ２ Ｌ反 应 体 系 ： 品 ２ Ｌ， 下 ． Ｃ Ｏ 样 上 游 弓 物 １ Ｌ， Ｎ ｓ２ Ｌ， Ｏ×Ｂ ｆ ｒ Ｍｇ １ ２ Ｉ ｄ ＴＰ １ ｕｆ （ Ｃ ２ ｅ Ｌ Ｔ ｑＤ ， ａ ＮＡ 聚合 酶 ０ ３ Ｌ， 菌 双 蒸 水 加 至 ２ ． 灭 ０ Ｌ 。Ｐ Ｒ程 序 ： ４ ３ｍｉ ，９ ℃ １ｍｉ ，５ ℃ ４ Ｓ Ｃ ９℃ ｎ ４ ｎ ２ ５，
毒 （Ｐ 、 Ｆ Ｖ） 猫传 染 性腹 膜 炎 病 毒 （ Ｉ Ｖ） 均 由本 实 ＦＰ ， 验 室 分 离 保 存 。试 剂 Ｔ ｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 ， ｒ ｅ－ ａ Ｍａｋ ｒ
ＤＬ ２０ ０ Ｐ ＡＳ — 一 ０ ， Ｅ Ｙ Ｔ１载体 和 Ｍａ ｃ ｌＴ１菌 液 （ ｒｈ — 北
扩增 。 １ ６ 特 异 性 试 验 从 Ｆ ． ＨＶ １ Ｆ Ｖ、 Ｉ Ｖ 的病 毒 － 、 Ｐ ＦＰ 保 存液 中提取 病 毒 ＤＮＡ， 入 该 Ｐ Ｒ 反 应 体 系进 加 Ｃ 行 扩增 ， 测该 方法 的特 异性 。 检
１１ 材 料 ．
猫 疱 疹 病 毒 工型 （ ＨＶ－ ） 猫 细 小 病 Ｆ １、
Ｃ ｉｅｅ ｏ ｒａ ｆ ｔｒ ａｙＭｅ ｉｎ ｈｎ ｓ ｕｎ ｌ ｅｉ ｒ ｄｃ ｅ Ｊ ｏ Ｖｅ ｎ ｉ
中 国兽 医杂 志 ２ １ 年 （ ４ ０ １ 第 ７卷 ） ５期 第
２５
Baidu Nhomakorabea
猫 病 毒 性 鼻气 管 炎 Ｐ Ｒ检 测 方法 的建 立 与应 用 Ｃ
屈 哲 。 ，徐 镔 蕊 ，睢 艳 平 ，王 勇 杜 艳 。 ，
收 稿 日期 ：２ ０ —９２ ０ ７０—６ 作 者 简 介 ： 哲 （９ ２） 女 ， 习 研 究 员 ， 士 ， 事 药 品 科 研 工 屈 １８ 一 ， 实 硕 从
。
Ｇ － 由北京优 博基 因科 技 有 限公 司合 成 。 Ａ ３， １ ３ 提 取 ＤＮＡ ． 含有 病毒 的分 泌物溶 于灭 菌生 理
盐水 ， 心 弃 上 层 液 体 后 加 入 裂 解 液 和 蛋 白酶 Ｋ 离
５ ℃水浴 消 化 ２ ｈ以上 ， Ｔｒ 饱 和 酚 和 酚 ：氯 ６ 用 ｉ ｓ
京全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司 ） ｄ ， ＮＴＰ ， ｕｆｒ ｓ Ｂ ｆｅ （ Ｃ ， Ｍｇ １ 随机 引物 （ 京优 博基 因科 技 有 限公 司提 ） 北 供 合成 ） 。 １ ２ 引 物 根 据 Ｇｅ Ｂ ｎ 中注 册 的 Ｆ ． ｎ ａｋ ＨＶ一－ １ＴＫ 基 因 ， 助 Ｐ ｉ ｒ Ｐ ｅ ｅ５ 借 ｒ ｍｅ ｒｍｉｒ．０软 件 ， 计 针 对 设
多次 发现 临床 可 疑病例 。但兽 医 临床还 只依 靠传 统 的诊 断方 法 ， 断 结果 不准 确 ， 诊 实验 室诊 断也 主要 依
靠病 毒分 离 和血 清学方 法 ［ ， 程费 时 、 ８过 ］ 费力 。而聚
合 酶链 式 反应 （ ｏｙ ｒｓ ｈ ｉ ｅｃｉｎ Ｐ Ｒ） ｐ ｌｍｅａｅｃ ａｎ ｒａ ｔ ， Ｃ 具 ｏ 有 敏感 、 异 、 特 快速 的优 点 ， ］ 特异 性 Ｐ Ｒ检 测方 法 Ｃ 的建立 ， 预 防 ， 对 治疗及 根 除 Ｆ ＨＶ－ １有重 大 意义 。
１ 材 料 与 方 法
后 ，取 ３ Ｌ Ｐ Ｒ产 物 用 １ ０ 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 Ｃ ．
泳检测 。
１ ５ 敏感 性试 验 从 眼分泌 物 中提取 的病毒 ＤＮＡ ． 在紫 外 分 光 光 度 计 上 测 定 浓 度 ， Ｏ Ｌ 体 系 中 含 ２ ＤＮＡ 量约 为 ３ ｇ 按 １ 至 １ 作 １ ， Ｏ ０ Ｏ倍 连 续 稀 释 ，再作 为 模 板 加入 该 Ｐ Ｒ反 应 体 系 中进 行 Ｐ Ｒ Ｃ Ｃ
７ ℃４ ｓ ３ ２ ５ ， ０个 循 环后 ７ ℃作用 １ ｎ ２ ０ｍｉ。反应 结 束
猫 鼻气 管炎 病 毒 （ Ｒ 是 １ ５ Ｆ Ｖ） ９ ８年 Ｃ ａ ｄ ｌ等 ｒｎ ｅｌ 首次 从美 国分 离 ［ 。随后 相继发 现 于加 拿大 、 国、 ７ ］ 英
荷兰 等地 。 目前 ， 国 Ｆ 我 ＨＶ一 病 率 呈 上 升 趋 势 ， １发