免疫荧光染色

免疫荧光一般步骤

固定液配制：

常用固定液为4%多聚甲醛，将40g多聚甲醛粉剂在三角烧瓶中溶于1000ml 0.1M PB溶液中,放入磁力转子置于加热磁力搅拌器中加热溶解，温度切忌超过70℃，温度过高会导致多聚甲醛解聚成为甲醛，遮蔽抗体影响抗原抗体结合，溶解后待其冷却，调节PH值至7.4，过滤后室温或4℃放置备用，配好后一个月内有效，最好现配现用。2.5％多聚甲醛(含苦味酸300ml／1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为NaH2PO4.２H2O 3.74g；Na2HPO4.12H2O45.11g（500ml:1.87g,22.55g）

灌注固定：

快速生理盐水冲净血液（约需要100ml即可），4%多聚甲醛灌注（快速充灌100ml 左右，再慢速滴150ml）。灌注用的针头前端要磨平，灌注小鼠可以用较粗的头皮针，仅留1cm，插入左心室即可，不必像大鼠那样插入主动脉根部。

取材

按要求不同取组织，取材部位一定要事先确定好，比如脊髓呈现节段性变化，只有取到正确的部位才能获得结果。坐骨神经对应的脊髓阶段（３，４，５）在第一腰椎下，第五腰椎下是第五神经节，对应髂前上棘（动物其实不叫这个名）前缘。

后固定及蔗糖脱水：

组织取材后切成小块放入4%多聚甲醛中，为后固定，建议4℃过夜，随后转入40%蔗糖溶液中脱水（不沉底），3天后即可用于冰冻切片。后固定时间亦不可过长。脱水不彻底表现为组织切片上空洞样组织破坏；固定不完全表现为微米染色集中在周边，组织内部不着色。蔗糖溶液亦用0.1M PB配制（见附录）。

冰冻切片：

漂染时，脊髓片厚可以25~30微米，神经节片厚要30微米

免疫荧光染色：

1.TBS溶液清洗组织片5分钟×2，有利于抗原抗体结合（可选）

2.封闭液（10％血清+1%BSA）＋0.3%triton-100*室温封闭2小时，亦可4℃过夜，除个别

膜抗原外，都需要加triton-100*;个人习惯的做法是把封闭液分装成1ml/管，保存在-20度，用前添加3微升triton-100

3.一抗孵育4℃过夜，一抗浓度需要通过预实验进行确定，比较常见的是１μｇ／ｍｌ。（一

抗稀释液见附录，建议用）

4.TBS溶液清洗组织片5分钟×3

5.二抗孵室温两小时或4℃过夜，感觉背景深的话,建议4℃过夜。

6.TBS溶液中置于摇床上清洗组织片5分钟×3

7.暗室内将组织片贴于载玻片上，室温晾干，载玻片最好经甲醛明胶处理过,防止粘不牢

脱片。微弱的光线对贴片造成相当的困难，特别是像神经节和小鼠脊髓这样的较小的切片，切片皱折，相互覆盖都会导致无法拍照，我的经验是可以用吸管将切片全部吸到载玻片上，然后尽量吸掉水，也可用毛笔等进一步去掉水份，然后室温晾干，大约一小时左右即可。光线方面也不是特别严格，可以用台灯的反射光进行照明，目前认为只要不是光线直射就可以。

8.90%甘油封片，注意汽泡。90%提前配好，用一个20ml玻璃小瓶或者试管，加入甘油和

PBS（或者TBS OR 生理盐水）混匀，放置以消去气泡。封片时甘油通常会加多，可以在封片后用卫生纸或者滤纸在边缘吸取多余的甘油，以防止粘到显微载物台上。

9.荧光观察

10.荧光双标与单标程序相同，也可顺序标记，购买带有相应荧光标记的一抗是个好办法。购买抗体后首先是确定抗体的有效性并确定抗体的工作浓度，有效性是通过阳性对照（有蛋白表达的组织标本）来实现，确定抗体的工作浓度要用不同的稀释比例分别染来实现，比如1：100，1：200，1：500，三个浓度，可以节约抗体，用加有叠氮钠的抗体稀释液（见下）也可回收抗体保存在4度，可用2-3次；抗体一般要分装保存在-20度，解冻用不完的抗体可4度保存两周；阴性对照也是必须的，即不加一抗只加二抗，特别是染新蛋白的情况下。

附：

1.Tris缓冲液配方（0.5M,PH7.6 10×）：Tris 60.57g；1N HCL(N是当量,相当于一元有效物1M，1N

盐酸桐当于1M盐酸，而1N硫酸相当于0.5MT硫酸)约420ml 双蒸水加至1000ml 先以少量双蒸水溶解Tris,加入HCL后，调至7.6，此液为储存液,4℃保存。

2.TBS配方:Tris-HCL缓冲液100ml加NaCl8.5～9g双蒸水加至1000ml

3.一抗稀释液：15Mm/L NaN3 ,1%BSA,0.01M/LPBS PH7.4

4.甲醛明胶: 40%甲醛2.5 ml ,明胶0.5 g 蒸馏水至100 ml,配制方法：用少许蒸馏水（约80 ml）加热溶

解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100 ml混匀即可。

5.0.1M PB：Na2HPO4 12H2O 28.7g,NaH2PO4 2H2O 2.96g,用1000ml双蒸水溶解。

6. 2.5％多聚甲醛(含苦味酸300ml／1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为

NaH2PO4.２H2O 3.74g；Na2HPO4.12H2O45.11g（500ml:1.87g,22.55g）

7.免疫荧光用到的材料：较大剪刀（灌注），大号止血钳（灌注），中号止血钳（灌注），多聚甲醛（灌

注）磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、蔗糖、滤纸、三角烧瓶（灌注），小鼠灌注需20ml注射器两个，头皮针（将头皮针插入左心室即可），六孔板（清洗切片），染色板（为圆底塑料板，可节约抗体），tris 碱，甘油，载玻片，盖玻片，毛笔（大小号），triton-100,牛血清白蛋白(BSA),叠氮钠,血清,盐酸,枪头,EP管,饭盒(遮光用),眼科剪,镊子。

8.相关软件:Photoshop、ImagePro(图像分析)、Sigmaplot(统计作图)

免疫组化的功能是对蛋白进行定性和半定量，定量比较理想的是结合western blot，不能结合的，需要足够的标本并选取一定量的切片数量，一般需三个样本，每个样本7-8张切片。

*因triton-100是油性的液体，易粘到吸管的外壁上导致加样多于3微升，建议吸取3微升的液体之后，用纸擦拭然后再进行加样。