蛋白纯化办法大全及优缺点比较
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化在生物化学等研究应用中广泛使用，是一项重要的操作技术。
蛋白纯化的基本原则,就是要利用不同蛋白间内在的相似性与差异。
利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
因为每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异采用不同的方法可以把蛋白质提纯出来。
蛋白质的分离纯化一般程序可以分为前处理、粗分级分离、细分级分离三步。
前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
粗分离：当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来,除去蛋白溶液中的较大杂质。
一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。
细分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。
进一步纯化分离颗粒较小或和样本性质较接近的杂质，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。
用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。
结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。
尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。
结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。
由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。
下面简单介绍下，蛋白质的分离纯化方法的原理：离子交换层析法离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。
几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。
蛋白纯化方法大全及优缺点比较
蛋白纯化方法大全及优缺点比较1. 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。
硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。
硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。
蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。
在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。
其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。
除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。
蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。
其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
2. 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。
不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。
假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用予大规模纯化中。
新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。
也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法蛋白质是生命体内最基本的分子，它们参与了生命体内的许多重要生物学过程，如代谢、信号转导、免疫防御等。
因此，对蛋白质的研究具有重要的科学意义。
但是，蛋白质在生物体内的含量很少，且与其他成分相混合，因此需要通过分离纯化的方法来获取纯净的蛋白质样品。
本文将介绍几种常用的分离纯化蛋白质的方法。
1. 溶液层析法溶液层析法是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它基于蛋白质在不同的化学性质和结构特征下在固定相中的不同亲和力，通过不同的溶液组成、pH值、离子强度等条件来分离纯化蛋白质。
溶液层析法的操作简单、效果好，可以分离出高纯度的蛋白质。
但是，它需要对分离材料的性质和蛋白质的性质有深入的了解，以便选择合适的分离条件。
此外，溶液层析法需要大量的分离材料和实验室设备，成本较高。
2. 凝胶层析法凝胶层析法是一种基于蛋白质分子大小、形状和电荷等性质的分离纯化方法。
它利用凝胶作为分离材料，通过分子筛效应、凝胶孔道大小和分子电荷等因素来分离不同大小和电荷的蛋白质。
凝胶层析法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是，它需要长时间的分离过程，而且凝胶的孔径大小和材料的性质会影响分离效果。
此外，凝胶层析法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。
3. 电泳法电泳法是一种通过电场作用将不同电荷的蛋白质分离的方法。
它利用电泳移动速度与蛋白质质量和电荷密度之间的关系，将蛋白质分离纯化。
电泳法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是，它需要专业的电泳设备和实验技能，而且对蛋白质的性质和电泳条件有较高的要求。
此外，电泳法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。
4. 亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与其配体之间的亲和作用来分离纯化蛋白质的方法。
它利用配体与蛋白质的特异性结合来分离纯化目标蛋白质。
亲和层析法具有分离效果好、选择性高、可重复使用等优点。
但是，它需要高纯度的配体和专业的实验技能，而且对蛋白质的性质和配体的选择有较高的要求。
蛋白质分离和纯化的方法和技术
蛋白质分离和纯化的方法和技术蛋白质是生命体中极其重要的一种物质，它是细胞的基本组成单位，参与了多种生物学过程。
研究蛋白质在细胞中的功能与结构，需要对蛋白质进行高效、可靠的分离和纯化。
本文将介绍常用的蛋白质分离和纯化的方法和技术。
一、离子交换层析离子交换层析是分离蛋白质最常用、最成熟的方法之一。
其原理是利用蛋白质的电荷性质与离子交换树脂的对应性质，进行蛋白质的分离。
离子交换树脂可分为正离子交换树脂和负离子交换树脂两种类型。
正离子交换树脂的功能基团有负电荷，故可吸附具有正电荷的物质，例如氨基酸、多肽或蛋白质N端等；负离子交换树脂的功能基团有正电荷，故可吸附具有负电荷的物质，例如天冬氨酸、谷氨酸、磷酸基或蛋白质C端等。
根据目标蛋白质的电荷性质，选择合适的离子交换树脂进行分离。
离子交换层析速度较快，可分离多种电荷性质的蛋白质，但对样品的盐浓度要求较高，易受pH和盐浓度的影响，操作时需谨慎。
二、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是利用孔径大小对蛋白质进行分离的方法。
凝胶过滤层析常用的凝胶有玻璃纤维、纤维素等。
玻璃纤维凝胶一般有不同的颗粒大小，大的颗粒孔径大，小的颗粒孔径小。
蛋白质分子较小，可通过大孔径的颗粒进入凝胶孔隙，而较大的物质被挡在颗粒外部无法穿过凝胶。
因此，蛋白质经过凝胶时易出现分子量排阻效应，使得小分子在大分子之前流出，从而实现了蛋白质的分离。
凝胶过滤层析操作简单，无需特殊设备或条件，但分离程度相对较低，不适宜纯化目标蛋白质。
三、亲和层析亲和层析是利用蛋白质与亲和柱中特定配体发生特异性结合，从而对蛋白质进行分离的方法。
亲和层析适用于具有特定结构、功能或序列的蛋白质，例如抗体、标签化蛋白、细胞受体等。
常见的亲和柱配体有融合蛋白、金属离子、细胞色素C等。
蛋白质样品在亲和柱上进行结合，待不结合蛋白质被洗脱后对结合蛋白质进行洗脱。
亲和层析具有选择性强、纯化程度高等优点，但亲和柱的制备成本较高，操作上也需注意其特异性。
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择蛋白质纯化是一种将复杂的混合物中的目标蛋白质分离出来的过程，其目的是获得纯度较高的蛋白质样品，以便进行进一步的研究。
在蛋白质纯化过程中，选择适当的方法至关重要，以下是一些常用的蛋白质纯化方法及其特点：1.溶液沉淀法溶液沉淀法是最简单和最常用的蛋白质纯化方法之一、基本原理是通过改变蛋白质的溶解度，使其从溶液中沉淀出来。
常见的溶液沉淀剂有硫酸铵、磷酸铵和醋酸锌等。
这种方法适用于将目标蛋白质从复杂的混合物中富集出来，但无法获得高纯度的蛋白质样品。
2.离子交换层析法离子交换层析法利用离子交换树脂对蛋白质进行分离和纯化。
树脂中的功能基团能够与蛋白质的带电基团发生相互作用，吸附或释放蛋白质。
离子交换层析法适用于富集带相同电荷的蛋白质，但不能获得高纯度的蛋白质样品。
3.亲和层析法亲和层析法利用目标蛋白质与特定配体之间的特异性结合进行分离和纯化。
常见的亲和层析方法包括亲和层析柱和亲和标记技术。
亲和层析法能够选择性地富集目标蛋白质，并获得较高纯度的样品。
但该方法需要配体的特异性和标记的技术支持。
4.尺寸排阻层析法尺寸排阻层析法是一种按照蛋白质在柱子中通过的速度进行分离和纯化的方法。
根据蛋白质的尺寸大小选择不同的尺寸排阻柱，较大的蛋白质在柱子中通过的速度较快，较小的蛋白质在柱子中通过的速度较慢。
尺寸排阻层析法适用于富集目标蛋白质，并能获得较高纯度的样品。
5.电泳法电泳是一种将蛋白质根据其电荷和尺寸分离和纯化的方法。
常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦和二维凝胶电泳等。
电泳法可以获得高纯度的蛋白质样品，但对蛋白质稳定性和成本要求较高。
综上所述，蛋白质纯化方法的选择应根据目标蛋白质的特性和纯度要求决定。
在实际操作中，常常需要结合多种方法进行联合纯化，以获得更高纯度的蛋白质样品。
此外，还应根据实验室的设备和技术条件，选择适合的蛋白质纯化方法。
四种蛋白纯化方式的原理及优缺点的简述
一.分子筛（凝胶层析）原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。
优点：1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。
2.实验操作相对简单3.条件温和，对蛋白活性保持率高4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。
缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。
2. 层析柱装填困难3.对上样量有要求4.测定柱效困难5.反复使用层析柱困难二.亲和层析原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。
优点:1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。
此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。
此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。
缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。
三.离子交换层析原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。
蛋白质纯化常用方法
蛋白质纯化常用方法蛋白质纯化是一种分离高纯度蛋白质的过程，可用于研究物种的功能和结构。
蛋白质纯化可以是一个繁琐的过程，通常需要多步骤的分离和纯化。
以下是一些常见的蛋白质纯化方法。
一、离心分离离心分离是根据蛋白质的分子量和密度差异来分离不同的成分。
高速离心法可分离细胞质组分、胞器、膜蛋白和核酸等。
低速离心法可从混合物中净化纤维蛋白、酶、酰化酶等。
二、盐析盐析是将溶液中的蛋白质与一定饱和度的盐混合后，通过离子间作用而使蛋白质发生沉淀的过程。
盐的浓度、pH值、离子类型和温度等因素会影响到沉淀的生成和纯度。
盐析也可以通过凝胶过滤或离子交换等方法来提高效果和纯度。
三、凝胶柱层析凝胶柱层析是一种将混合物缓慢地通过一个由多种凝胶材料组成的列的过程。
该列可根据蛋白质大小、电荷、亲疏水性等特性进行选择。
通过这种方法，可以净化蛋白质并快速消除杂质、缓解蛋白结构等。
四、亲和层析亲和层析是一种利用配体与蛋白质间的特定的结合进行选择性分离的技术。
配体通常被共价结合在凝胶上, 一些常见的配体包括金属离子、抗体和亲和素等。
通过这种方法，可以高效且选择性地纯化蛋白质，并减少染料、盐和杂质的存在。
五、电泳电泳是根据蛋白质的电荷大小将充电的蛋白质分离开的过程。
根据电泳类型不同，可以区分不同细胞蛋白、酶、抗体等。
蛋白质电泳在生物化学实验室中广泛应用，是一种可视化分离的传统方法。
六、共沉淀共沉淀是基于化合物的亲和性，在溶液中同时存在的两种蛋白质之间发生非共价结合的过程。
通过共沉淀获得的纯化蛋白质收率较高但一般会伴随着蛋白质活性的损失。
总之，纯化蛋白质的过程需要结合样品的特性和分离纯化方式的优点和局限性，选择合适的技术来获得高纯度和活性的蛋白质。
蛋白质的纯化方法
蛋白质的纯化方法蛋白质是生命体中最基本的组分之一，对于深入理解生命科学方面的各个领域是至关重要的。
然而，蛋白质作为生物大分子，其结构和特性十分复杂，因此需要采用一系列的纯化方法，使其从杂质中得以分离出来。
1. 盐析法盐析法是通过不同浓度的盐水进行分离蛋白质。
盐水的浓度会对蛋白质的稳定性、电荷、溶解度以及亲水性产生影响，使得蛋白质从盐水溶液中析出。
通过盐析法可以分离出不同的蛋白质分子量、电荷等性质相差较大的蛋白质。
这种方法可以用于初步分离，然后再用其他方法进一步纯化。
层析法依据蛋白质和基质之间的亲和力、大小、形状、电荷等差异进行分离。
将蛋白质样品通过某种基质包装的柱子进行逐层析出，蛋白质在不同基质上的亲和力使得其被不同基质吸附，最终通过洗脱等后处理方法，将其分离出来。
3. 水解法水解法是将蛋白质样品加入酸性或碱性等反应性溶液中，使蛋白质分子断裂成更小的肽链。
通过不同的水解方法和处理方法，可将蛋白质分离出来。
4. 电泳法电泳法根据蛋白质的电性和分子大小来进行分离。
通过蛋白质在电场中的电荷和电泳时的分子大小来颗粒分裂，将其分离出来。
电泳法包括等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE电泳、双向电泳等方法，其中比较常用的是SDS-PAGE电泳。
5. 亲和层析法亲和层析法利用蛋白质与特定配体之间的强亲和力来进行分离。
通过在某一配体上固定蛋白质，利用比较特异的亲和性从多种蛋白质中选择性地吸附目标蛋白质，最终将目标蛋白质从基质中析出。
透析法是一种通过滤过和受限扩散等原理，通过基质和蛋白质之间的分子量和性质差异来进行分离。
透析法通常用于去除杂质，如去除蛋白质样品中的盐、淀粉等。
综上所述，蛋白质纯化方法的选择取决于蛋白质的性质，结构和形态等因素。
无论采用哪种方法，都需要在实验前根据目标蛋白质的性质进行调研和试验，谨慎选择，才能得到理想的分离效果。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
一、凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它利用蛋白质的电荷和大小差异，在电场作用下，将蛋白质分离成不同迁移速度的带状物。
常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺糖凝胶电泳（PAGE）等。
凝胶电泳具有分离速度快、样品适用范围广、易于操作等特点。
二、离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography）：离子交换层析是根据蛋白质表面带电性的差异来分离纯化蛋白质的方法。
通过将样品加入装有离子交换树脂的层析柱中，通过控制洗脱缓冲液的离子浓度和pH，实现带正电荷或负电荷的蛋白质与树脂之间的相互作用，从而实现分离纯化。
三、亲和层析法（Affinity Chromatography）：亲和层析是利用蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来分离纯化蛋白质的方法。
常见的亲和层析方法包括亲和纸层析、亲和树脂层析等。
该方法具有选择性强、纯化效果好的优点，广泛应用于蛋白质纯化领域。
四、凝胶渗透层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶渗透层析也被称为分子筛层析，是一种以分子大小差异作为分离依据的方法。
通过在层析柱中加入一种孔隙较小的凝胶，利用蛋白质分子大小的差异，在经过柱体后，较小的蛋白质分子进入凝胶孔隙中，分离出来，而较大的蛋白质则能够直接流出。
五、逆流层析法（Reverse Phase Chromatography）：逆流层析是基于蛋白质与固定相之间的亲疏水性相互作用进行纯化的方法。
固定相常为亲疏水性的碳链，样品在不同的流动相条件下，通过调节流动相的成分和性质，来实现对蛋白质的分离纯化。
此外，还有疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography）、互补杂交法（Complementary Hybridization）等方法。
蛋白纯化方法
蛋白纯化方法蛋白纯化是生物化学领域中非常重要的一环，它是指将混合的蛋白质溶液中的目标蛋白质与其他蛋白质、核酸、多糖等生物大分子分离出来的过程。
蛋白纯化的方法有很多种，每一种方法都有其特定的应用场景和适用对象。
在本文中，我们将介绍几种常见的蛋白纯化方法，希望能对您有所帮助。
一、离心法。
离心法是一种常用的蛋白纯化方法，其原理是利用不同蛋白质在离心过程中受到的离心力不同而实现分离。
通过逐步增加离心力，可以将混合蛋白质溶液中的不同蛋白质分离出来。
离心法适用于分子量差异较大的蛋白质，但其操作过程较为繁琐，需要较长的离心时间。
二、凝胶过滤法。
凝胶过滤法是利用凝胶孔隙大小的差异将不同大小的蛋白质分离的方法。
在凝胶柱中，大分子蛋白质无法进入凝胶孔隙，只能在凝胶表面流动，从而被分离出来。
凝胶过滤法操作简单，适用于分子量较大的蛋白质。
三、离子交换层析法。
离子交换层析法是利用蛋白质表面带电性质的差异将蛋白质分离的方法。
在离子交换柱中，蛋白质会根据其带电性质的不同而被吸附在柱子上，通过改变缓冲液的离子浓度和pH值，实现蛋白质的分离。
离子交换层析法适用于带电性质不同的蛋白质。
四、亲和层析法。
亲和层析法是利用亲和剂与目标蛋白质之间的特异性结合来实现分离的方法。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，它们与目标蛋白质具有特异的结合能力，通过在柱子中固定亲和剂，可以将目标蛋白质特异地吸附在柱子上，然后通过改变条件将其洗脱出来。
亲和层析法适用于具有特异结合亲和剂的蛋白质。
五、透析法。
透析法是一种利用半透膜将小分子溶质与大分子溶质分离的方法。
在透析过程中，溶液被置于半透膜袋中，通过半透膜的选择性通透性，可以将小分子溶质从大分子溶质中分离出来。
透析法操作简单，适用于蛋白质与小分子溶质的分离。
总结。
蛋白纯化是生物化学研究中非常重要的一环，不同的蛋白纯化方法适用于不同类型的蛋白质。
在进行蛋白纯化时，需要根据目标蛋白质的特性选择合适的纯化方法，以实现高效、纯度高的蛋白质分离。
蛋白纯化
名解：1.截留分子量：不能通过膜的最小分子量2.超滤：是指选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法3.陶南效应：离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。
在阳IE表面的微环境中，H＋被吸引而OH－被排斥，交换剂表面pH比周围低1个pH单位；而阴IE表面的微环境中，H＋被排斥，交换剂表面pH比周围高1个pH单位4.离子交换剂的有效交换容量：指在一定的实验条件下，每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量5.聚沉：指在聚沉剂的作用下，溶液中的蛋白质相互聚集为较大聚沉物（＞1mm）的过程6.絮凝：是指在絮凝剂的作用下，通过吸附、交联、网捕，把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程7.盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升8.盐析：当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出9.透析：利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种方法10.排阻极限：指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量11.凝胶颗粒的分级范围：指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围12.过滤：是指利用多孔介质（滤纸、滤膜等）阻截大的颗粒物质，而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法13.离子交换剂的电荷密度：指IE介质颗粒单位表面积的功能基团数量，它决定着离子交换剂的总交换容量14.离子交换剂的膨胀度（吸水值）：指干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成的体积膨胀程度。
用每克干离子交换剂吸水膨胀后的体积表示（ml/g）15.梯度洗脱：洗脱过程中，洗脱缓冲液的pH或离子强度是连续发生变化的。
16.阶段洗脱：指在一个时间段内用一固定pH或I的条件进行洗脱，而在下一个时间段内用另一固定pH或I的条件进行洗脱的分段式洗脱方式17.亲和层析：利用蛋白质与其专一性配体之间的特异性生物学亲和力作用，对蛋白质进行分离纯化的层析技术18.等点聚焦电泳：利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一种电泳技术19.双向电泳：双向电泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE）是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分别纯化蛋白质的办法及道理（一）应用分子大小1.透析：道理：应用蛋白质分子不克不及透过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物资如无机盐.单糖.水等离开.办法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：若何加速透析进程（1）加大浓度差,实时改换透析液（2）应用磁力搅拌器经常应用的半透膜：玻璃纸.火棉和其他材料合成2.超出滤：道理：应用压力和离心力,强行使其他小分子和水经由过程半透膜,而蛋白质留在膜上3.凝胶过滤层析：道理：当不合分子大小的蛋白质混杂物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不克不及进入珠内网状构造,排阻在凝胶珠以外,在凝胶珠裂缝间隙中向下移动.而比孔小的分子不合程度地进入凝胶珠内,如许因为不合大小分子所阅历的路径不合而到分别.成果：大分子先被洗脱下来,小分子后被洗脱下来（二）应用消融度不同4.等电点沉淀：道理：不合蛋白质具有不合的等电点,当蛋白质混杂物调到个中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全体被沉淀下来..5.盐析与盐溶：道理：低浓度时,中性盐可以增长蛋白质消融度这种现象称为盐溶.当离子强度增长,足够高时,例如饱和或半饱和程度,许多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析（三）依据电荷不合6.SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳道理：经由过程加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也解离为单亚基,处理后的样品中肽链是处于无二硫键衔接的,分别的状况.电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁徙率不再受蛋白质原有电荷和外形的影响,而重要取决于蛋白质分子量.所以SDS-PAGE经常应用来剖析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量.7.离子交流层析：道理：氨基酸分别经常应用阳离子交流树脂,树脂被处理成钠型,将混杂氨基酸上柱,氨基酸重要以阳离子情势消失,在树脂上与钠离子产生交流,而被挂在树脂上.氨基酸在树脂上联合的稳固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力,决议亲和力的身分有：（1）主如果静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水感化氨基酸与阳离子交流树脂间的静电引力大小次序依次是：碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0.是以洗脱次序应当是：酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸为使氨基酸从树脂上洗脱下来采取慢慢进步pH和盐浓度的办法。
亲和层析法纯化荧光蛋白
亲和层析法纯化荧光蛋白摘要本文介绍了亲和层析法作为一种常用的蛋白纯化方法，并重点讨论了其在荧光蛋白纯化中的应用。
我们将详细介绍亲和层析法的原理、常用的亲和标靶、操作步骤以及优缺点。
此外，我们还将介绍一些关于荧光蛋白纯化的实验示例和技巧，以帮助读者更好地理解和应用亲和层析法。
1. 引言蛋白的纯化是研究蛋白结构、功能以及相互作用的关键步骤之一。
在过去的几十年中，人们提出了多种蛋白纯化方法，其中亲和层析法因其简便快速、高纯度和高产率的特点而被广泛应用。
亲和层析法是基于蛋白与其特异性结合物质的相互作用而实现纯化的方法。
在荧光蛋白纯化中，亲和层析法被广泛用于提高纯度和产量。
2. 亲和层析法原理亲和层析法的原理基于荧光蛋白与其特异性结合物质（亲和标靶）的相互作用。
亲和标靶可以是化学修饰后的配体、亲和剂或抗体等。
荧光蛋白与其特异性结合物质之间的结合是可逆的，因此可以通过适当的条件将荧光蛋白与亲和标靶分离。
在亲和层析法中，通常会将亲和标靶固定在亲和层析柱上，然后将荧光蛋白溶液通过柱子。
与亲和标靶结合的荧光蛋白会在柱子上保留，而其他的蛋白质则会流出。
随后，通过改变条件，如改变溶液pH值、离子强度或引入竞争性结合剂等，可以实现荧光蛋白与亲和标靶的分离。
3. 常用的亲和标靶在荧光蛋白纯化中，常用的亲和标靶有金属离子、亲和剂和抗体等。
金属离子是一种常见的亲和标靶。
荧光蛋白中常含有结合金属离子的位点，如钙离子、锌离子等。
通过调节溶液中金属离子的浓度或添加竞争性配体，可以实现荧光蛋白与金属离子的结合和分离。
亲和剂是一种特殊的小分子化合物，它们具有与目标蛋白特异性结合的能力。
在荧光蛋白纯化中，亲和剂可以选择与荧光蛋白的特殊结构域或修饰基团结合，实现纯化和分离。
抗体是一种高度特异性的蛋白质，可以与荧光蛋白的特定抗原决定簇结合。
通过将荧光蛋白与特异性抗体结合，可以有效纯化荧光蛋白。
4. 亲和层析法的操作步骤亲和层析法的操作步骤包括亲和标靶固定、样品加载、洗脱和再生等。
蛋白质纯化方法的比较与优化
蛋白质纯化方法的比较与优化蛋白质是构成生命体系的基本成分之一，对于科研、医药、食品等领域都有着举足轻重的作用。
然而，由于蛋白质自身的特性，如大小、电荷、亲疏水性等的差异，以及样本来源的差异，蛋白质的分离、纯化难度也相应增大。
因此，蛋白质纯化方法的比较与优化显得尤为重要。
一、蛋白质的分离和纯化常见的蛋白质纯化方法包括离心、柱层析、电泳、亲和层析、逆相色谱和凝胶过滤等。
这些方法各有优缺点，选择合适的方法需要考虑到样品的特性、纯化效率、时间成本等多个因素。
离心法通过对离心力的调控实现对蛋白质的简单分离。
此方法分离效率高，操作简单，但无法获得高纯度的蛋白质，并且需要大量的试剂和设备投入。
柱层析法则是在固相柱上利用蛋白质与柱填充物之间相互作用差异的原理实现纯化。
基本上可应用于任何类型的蛋白质，且可实现比离心法更高的纯度。
但同时，不同的填充物和操作条件对纯化效果、靶蛋白的稳定性等都有影响，因此柱层析的优化也显得十分重要。
电泳法是通过应用电场实现对蛋白质的移动，可以实现高分辨率的分离。
但由于操作技术要求高，且在高分子量或亲疏水性相近的情况下分离效果会降低，因此电泳并不是每种蛋白质的首选方法。
亲和层析基于靶蛋白与一种确定配体间的特异性相互作用实现分离和纯化。
优点在于分离效果结果稳定，可以高效地分离靶蛋白，但合适的配体和条件筛选与选择是分离效果和操作成本的关键。
逆相色谱法的原理是基于亲水性的差异实现分离的，由于核心工作原理跟柱层析相近，因此逆相色谱法也常与柱层析法一同使用。
凝胶过滤法则利用凝胶的孔隙分布特性，不同大小分子通过凝胶的孔洞随孔隙大小而流过，直接实现对蛋白质的分离。
此方法适合于大分子量蛋白质的分离，但分离效率和强度对凝胶孔隙大小的孔隙分布十分敏感，因此需要精确控制条件和多种类型凝胶的选择进行和优化。
二、蛋白质纯化方法的优化对于以上分离方法，每种方法都有优缺点，纯化效果和成本也因特定实验的要求而各异。
因此，如何针对样本特性、操作条件进行合适的选择和优化，对于蛋白质纯化有着不可低估的影响。
蛋白纯化常见问题解析
蛋白纯化常见问题解析蛋白纯化是生物学实验中的关键环节，旨在从复杂的生物样本中分离和提纯出目标蛋白质。
然而，在蛋白纯化的过程中，研究人员常常会遇到各种问题和挑战。
这些问题可能源于样本的复杂性、蛋白质的特性，或是纯化技术的局限性。
为了成功地进行蛋白纯化，理解并解决这些常见问题至关重要。
下面是关于蛋白纯化的相关问题解析，希望对你有帮助：一、蛋白质的纯化技术有哪些？①沉淀法②电泳在克隆基因表达产物的检测分析过程中，电泳是常用的方法，但在纯化蛋白时，通常都不采用电泳的方法。
由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白质，常用下述方法进行：①从电泳后的凝胶上切下所需的相应条带，将凝胶压碎，用缓冲液浸泡，使其中的蛋白质扩散出来，从而获得纯化的蛋白质。
此法简单但回收率低。
②将电泳后的凝胶用电洗脱的方法使蛋白质从凝胶转移到溶液中，从而达到纯化的目的。
此法快速，回收率高，但需要特殊的电泳装置。
③色谱法：色谱法（chromatography）是蛋白纯化中最常用的一种方法，这种方法既可以制备大量的纯化蛋白质，又可以保持蛋白质的生物学活性。
色谱的种类很多，可分为常规色谱和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）。
凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱等均为常规色谱法。
HPLC包括反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、离子交换高效液相色谱（ion exchange HPLC）等。
根据目标蛋白性质的不同可选用相应的色谱分离技术纯化蛋白质。
二、什么是最好的蛋白质纯化方法？常见的蛋白质纯化方法包括色谱法（如凝胶过滤、离子交换和亲和色谱）、电泳法（如SDS-PAGE和Native-PAGE）以及沉淀法（如盐析和有机溶剂沉淀）。
每种方法都有其独特的优缺点和适用范围。
例如，凝胶过滤色谱适用于大规模纯化，能够基于蛋白质的分子量进行分离；离子交换色谱则适用于根据蛋白质的电荷差异进行分离；而亲和色谱则特别适用于那些与特定配体有高亲和力的蛋白质。
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
蛋白质纯化方法及问题解答
蛋白质纯化方法及问题解答蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。
2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。
也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。
在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。
当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。
100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。
可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。
纯化蛋白质的三种色谱技术的优缺点
纯化蛋白质的三种色谱技术的优缺点亲和层析较常规的层析技术有许多优点，生物特异亲和层析的特异性和选择性是其他层析方法所不能比的，至少在实验室规模可以达到几乎100%的回收率，纯度提高1000倍以上。
因而，纳入亲和步骤可以大大减少纯化蛋白质所需要的步骤，从而节约了可观的时间和成本，在工业上尤其显著。
该项技术也有一系列缺点限制了它的发展。
许多生物特异配基都相当昂贵，而且常常不稳定；许多配基偶联技术很复杂、有毒、耗时，而且昂贵。
基于蛋白容易受化学物质的影响，导致活性降低，甚至失活。
因此，亲和层析纯化蛋白质应非常谨慎。
空间排阻层析，工作原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异进行分离。
该技术一般在分离纯化的后期，它的主要优势在于分辨率高。
另外，设备简单、操作方便，不需要有机溶剂也是该项技术的优势。
该技术要求上样体积必须小，一般是柱体积的2%-5%，如果样品纯度不够，很容易堵塞柱子。
虽然空间排阻层析是一项有效的分离技术，但是相对于上样体积而言，洗脱液一般都高度稀释。
和其他层析介质相比，柱流速也常常低得多，这导致过程时间长，如果在工业上应用，可能会使成本增加。
离子交换层析的基础是带电分子与固相基质的可逆的静电作用，固相基质上共价连接了与带电分子带相反电荷的侧链基团，改变pH值或增加洗脱缓冲液的盐浓度可以洗脱蛋白质。
绝大多数纯化过程都至少要用到一步离子交换，离子交换层析是蛋白质纯化中非常普遍的。
离子交换层析普及的基础是高水平的分辨率，可以直接放大规模（应用于工业），以及使用方便，柱再生容易，另外还使目标蛋白得到浓缩，操作费用也比较低。
大多数蛋白质在生理pH值的净电荷是负值，因此阴离子交换层析应用最普遍。
该技术也存在一些不足，比如机械强度差、易溶易胀、易受有机物污染。
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蛋白纯化方法大全及优缺点比较
1.?蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。
硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。
硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。
蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。
在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。
其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。
除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。
蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。
其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
2.缓冲液的更换?虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。
不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。
假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用予大规模纯化中。
新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。
也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。
蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。
蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、
起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。
3.离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。
基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。
树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。
蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。
大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，
极端的pH下蛋白会变性失活.应尽量避免。
由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。
在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。
在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。
但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。
与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。
值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
4.?亲和层析?亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
本方法存在的问题是：单抗非常昂贵，而且也需先纯化；单抗与目的蛋白结合力太强.要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的蛋白失活并破坏单抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合；某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中，也需要从终产物中去除。
亲和柱通常在纯化过程的后期应用，此时标本体积已缩小，大部分的杂质已经去除。
谷胱甘肽S-转移酶（GlutathioneS-transferase，GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适地折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。
组氨酸标签与GST相比有许多优点，首先，由于只有6个氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；另外6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。
虽然有这么多的优点，但此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。
镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。
若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合，或者需要某种特殊的辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。
5.?疏水作用层析蛋白是由疏水性和亲水性氨基酸组成的。
疏水性氨基酸位于蛋白空间结构的中心部位，远离表面的水分子。
亲水性氨基酸残基则位于蛋白表面。
由于亲水性氨基酸吸引了许多的水分子，所以通常情况下整
个蛋白分子被水分子包围着，疏水性氨基酸不会暴露在外。
在高盐浓度的环境中蛋白的疏水性区域则会暴露并与疏水性介质表面的疏水性配基结合。
不同的蛋白疏水性不同，与疏水作用力大小也不同，通过逐渐降低缓冲液中盐浓度冲洗柱子，在盐浓度很低时，蛋白恢复自然状态，疏水作用力减弱被洗脱出来。
疏水性树脂的选择性是由疏水性配基的结构决定的，常用的直链配体为烷基配体（alkylligands）和芳基配体（arylligands），链越长结合蛋白的能力也越强。
理想树脂种类的选择应根据目的蛋白的化学性质而定，不能选择结合力太强的树脂，结合力太强的树脂会很难洗脱，所以开始时应选用中等结合力的苯基树脂探讨条件。
为了使选择合适的介质更容易，AmershamBiosciences推出了疏水作用树脂选择试剂盒，里面包括5种不同的树脂供比较。
疏水层析很适合作为离子交换纯化的下一个步骤，因为疏水作用层析在高盐浓度下上样，从离子交换得到的产物不需更换缓冲液即可使用。
蛋白又在低盐缓冲液中洗脱，又省去了下一步纯化前的更换缓冲液的
步骤，既节约了时间，又减少了蛋白的丢失。
6.?排阻层析也叫凝胶过滤或分子筛。
排阻层析柱的填充颗粒是多孔的介质，柱中围绕着颗粒所能容纳的液体量叫流动相，也称无效体积。
太大的蛋白不能进入颗粒的孔内，只能存在于无效体积的溶液中，将会最早从柱中洗脱出来，对这部分蛋白无纯化效果。
由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异。
大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小，洗脱出来的越晚。
为得到最佳的纯化效果，应将孔径大小选在目的蛋白能在无效体积和总柱床体积的中点附近洗脱。
排阻层析有其他方法所不具备的优点，首先所能纯化的蛋白分子量范围宽，TosohBiosep公司的聚合物树脂，排阻极限可达200000kD；其次，树脂微孔的形状适合分离球形的蛋白质，纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。
应该注意的是某些蛋白不适合用凝胶过滤纯化，因为本技术所用树脂有轻度的亲水性，电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面。
排阻层析从不用于纯化过程的早期，因为这种方法要求标本高度浓缩，上样量只能在柱体积的1％～4％之间，柱子要细而长才能得到好的分离效果，树脂本身也比较昂贵，规模化的工业生产中不太适用。
7.电泳丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。
这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。
在基础研究中，有时仅需要少量的纯蛋白进行研究，如蛋白质测序等，此时电泳纯化不失为一种简便快速的好方法。
丙烯酰胺凝胶电泳也是蛋白纯化过程中重要的分析工具，可以检测目的蛋白是在哪个梯度的离子交换柱盐洗脱液中；可用来判定近年来随着各学科的迅猛发展，对蛋白纯化技术的需求不断增长，已有的纯化方法被日益改进，新型的纯化方法也相继涌现。
羟磷灰石是磷酸钙的结晶，由于其理化性质不够稳定，结合能力差，
很难用于层析。
近来来Bio-Rad公司对其进行了改进，提高了钙和磷的比例，使形成球形、多孔、性质稳定的陶瓷羟磷灰石颗粒，其带正电的钙离子和负电性的磷酸根离子可分别与蛋白的羧基及氨基结合。
通过调整缓冲液的pH值，酸性及碱性氨基酸可选择性地与此树脂结合，改变缓冲液的盐浓度可将蛋白洗脱分离。
资料显示，使用这种方法能使两种等电点、分子量和疏水性相同的蛋白很好分离。