高效液相色谱法

•固定液极性 > 流动相极性 •极性小的组分先出柱，极性大的组分 后出柱
正相色谱 NPLC
反相色谱 RPLC
•固定液极性 < 流动相极性 •极性大的组分先出柱，极性小的组分 后出柱
三、各类高效液相色谱法
化学键合相色谱法 化学键合相色谱法
(bonded (bonded phase phase chromatography,BPC) chromatography,BPC)
YWG YQG
高分子多孔微球 YSG 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
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四、固定相
化学键合相 特点： 不易流失;热稳定性好;化学性能稳定 载样量大;适于梯度洗脱 分类:
非极性键合相：ODS
四、固定相
非极性键合相：ODS 载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球 表面覆盖度：
二、基本原理
HPLC：
二、基本原理
范氏方程 范氏方程（ （van van Deemter Deemter equation) equation) H = A + Cu A=2λdρ C=Cm+Csm
影响因素： •λ ↓ • dρ↓ • C↓
1 B/u GC和HPLC的H-u图 2 Cu 3 A 4 HPLC的uopt 5 GC的uopt
分析对象
不受样品挥 发性和热稳定 性的限制，占 有机物的80%
• •液体，种类 较多，选择余 地广
流动相差别
一、概 述
HPLC仪器示意图
一、概 述
Agilent 1100
1
一、概 述
HPLC仪器图
一、概 述
application
SHIMAZU
WATERS AGILENT
高效液相色谱法
1 2 3 4 5 6 概述
二、基本原理
范氏方程（van Deemter equation)： GC： 填充柱 开口毛细管柱 HPLC： H = A + B/u + Cu H = B/u + Cu H = A + Cu
基本原理
各类高效液相色谱法 固定相 流动相 高效液相色谱仪
B 2 D m
Dm
T

原因： 原因：T T↓；η↑； ↓；η↑； u u↑→ ↑→ 忽略 忽略B/u B/u
五、流动相
5
HPLC
1 2 3 4 5 6 概述 基本原理 各类高效液相色谱法 固定相 流动相
输液泵
HPLC
六、高效液相色谱仪
进样器
色谱柱
高效液相色谱仪
检测器 工作站
高效液相色谱仪
六、高效液相色谱仪
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 泵： 恒压泵 恒流泵:柱塞往复泵
六、高效液相色谱仪
Agilent 二元泵示意图
参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。 其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。
中等极性键合相：醚基键合相
键合基团键长：键长↑，载样量↑，k↑
极性键合相：氨基、氯基键合相
HPLC
1 2 3 4 5 6 概述 基本原理 各类高效液相色谱法 固定相
五、流动相
要求： 与固定液不反应;对样品有良好溶解度 粘度小;与检测器匹配
高效液相色谱法
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
1 2 3 4 5
概述 基本原理 各类高效液相色谱法 固定相 流动相 高效液相色谱仪 小结 习题及解答
分析化学教研室
6
一、概 述
高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱 的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。
5 3
HPLC流动相的pH值应控制为 2-8 .
提高色谱柱柱效的可行方法是 ( ABCD ) A 选择小粒度的固定相 B 降低固定相的粒度分布 C 选择球形固定相 D 匀浆装柱 E 增加柱长 F 选择适宜流动相 G 降低流速
分析化学教研室
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C m C sm
dp 2 Dm
C
dp 2 Dm
Dm
T

选球形固定相，高压、匀浆装柱法 选粒径小的化学键合相 选粘度小、低流速的流动相
2
高效液相色谱法
1 2 3 4 5 6 概述 基本原理 1
三、各类高效液相色谱法
液固吸附色谱法（LSC） 液液分配色谱法（LLC）
各类高效液相色谱法
固定相 流动相 高效液相色谱仪 3 化学键合相色谱法（BPC） 2
GC
一、概 述
HPLC与GC区别
HPLC
简称：HPLC；HRLC；SPLC； UPLC 超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography） 与经典LC相比——高效
◇ 高效填料：3～5μm ◇ 高压泵输液 ◇ 高灵敏度的检测器:在线检测
•能气化、热 稳定性好、且 沸点较低的样 品，占有机物 的20% •惰性气体
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六、高效液相色谱仪
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 1. 2. 3. 4. 检测器: 紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
六、高效液相色谱仪
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
六、高效液相色谱仪
色谱－光谱图 色谱－光谱图
六、高效液相色谱仪
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
六、高效液相色谱仪
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
六、高效液相色谱仪
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成 分析柱 φ2-4.6mm L10-25cm 常量柱 制备柱 φ1-1.5mm φ20-50mm L10-20cm 常微量柱 L3-25cm
三、各类高效液相色谱法
3. 离子对色谱法(IPC,PIC) 分离机制：在流动相中加入离子对试剂，使形成 不带电的中性离子对，以改善分离 机理：
流动相 BH+ B+H+ + RSO3Na RSO-3+Na+ [BH+.RSO-3] 中性离子对 固定相
[BH+.RSO-3] ↗ 增加了在非极性固定相中溶解度。
R
流动相
高效液相色谱仪 α k
n 1 k2 4 1 k2
与固定相性质和流动相种类有关 与流动相配比有关
五、流动相
正相洗脱 反相洗脱 洗脱方式: 等度洗脱(isocratic elution) 恒定配比的溶剂系统洗脱 梯度洗脱(gradient elution) 在一个分析周期内不断改变流动相的比例 流动相的极性小于固定相的洗脱 流动相的极性大于固定相的洗脱
三、各类高效液相色谱法
常用离子对试剂：
分析对象 离子对试剂 例如
三、各类高效液相色谱法
4. 离子抑制色谱法(ISC) 分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解， 增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱 酸，弱碱的目的 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 7.0≤pKa≤8.0 的弱酸 的弱碱
碱
烷基磺酸钠
C5、C6、C7、C8磺 酸钠,SDS
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酸
四丁基季胺盐
四丁基胺磷酸盐 （TBA）
抑制剂: 弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
HPLC
1 2 3 4 5 6 概述 基本原理 各类高效液相色谱法 液-固色谱固定相
四、固定相
固定相
流动相 高效液相色谱仪
硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
三、各类高效液相色谱法
液固吸附色谱法 分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活 性中心 固定相:硅胶 流动相:底剂（烷烃）+ 极性调节剂 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 例如：TLC
三、各类高效液相色谱法
液液分配色谱法 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 分类:
WATERS WATERS
2414RID 波长 波长(nm) (nm)
2465ECD
T/min T/min
2489UVD
2424ELSD
六、高效液相色谱仪
超高效液相色谱仪(www.waters.com)
小结
掌握 熟悉 了解
•HPLC的特点. •HPLC的仪器结 构及各部件.
•HPLC中色谱条 件的选择. •化学键合相色 谱法.
三、各类高效液相色谱法
1. 反相键合相色谱法(RBPC) 分离机制：疏溶剂理论等 固定相：非极性的键合相 如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱) 流动相：极性大的流动相 如:甲醇-水或乙腈-水 流动相极性与k的关系: 极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 极性大的组分先出柱 应用：非极性--中等极性组分(80%)
固定液的官能团通过 化学反应键合在载体表面
反相键合相
正相键合相
离子对
离子抑制

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三、各类高效液相色谱法
2. 正相键合相色谱法(NBPC) 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
•范氏方程在 HPLC的表达形 式. •分离度影响因 素 •正相色谱和反 相色谱.
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习题及解答
反相色谱中固定相的极性 小于 流动相 的极性.
习题及解答
键合相的键合基团的碳链长度增长后 ( AC ) A极性减少 B极性增大 C载样量增大 D载样量减少
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HPLC中范氏方程的表达式为: H = A + Cu .