细胞内细胞因子染色
T细胞的分化培养、染色
T细胞的分化培养脾细胞的分离与计数：过滤PBS 10mL于离心管中，杀小鼠，取脾脏放入此PBS，冰浴。
配含10% FBS的1640培养液（5ml+45ml）。
平皿中研碎脾脏。
加PBS离心（1400 rpm,7 min)。
去上清，加2-3mL红细胞裂解液，吹打，静置5min。
加10 ml 1640（稀释掉裂解液），过滤（过筛），离心（1400 rpm，7 min）。
去上清，加之前配好的培养液3 mL打匀得悬液。
取少许入小管，于小管中取20uL，加20uL台盼蓝（染上死细胞）。
细胞计数，16大格板，计左上和右下对角线的各16小格。
算得结果。
此时细胞密度=一个角的16格细胞数×104/mL，由于台盼蓝稀释，再×2。
参照加样体积，取适量悬液用培养液稀释成1.5-2.5×106个/mL。
=台盼兰染色后150-250cells/左上16格+右下16格细胞因子的分装：原管分别含IL-2 :20 μg,IL-4 :10μg ,IL-12 :10μg ,TGF-β:1μg。
分别取1 ml所配培养液加入rmIL-2,rmIL-4,rmIL-12,rmTGF-β。
配1μg/ml的IL-2，100μL/管。
配1μg/ml的IL-4。
100μl/管。
配1μg/ml的IL-12。
50μl/管。
配1μg/ml 的TGF-β。
50μl/管。
分装1μg/ml的GM-CSF。
20uL/管。
细胞的激活培养：在总加样体积的细胞悬液中，加入下列细胞因子与抗体：稀释800倍的Anti-CD3（5ug/mL），稀释1000倍的Anti-CD28（1ug/mL），稀释500倍的IL-2（2 ng/mL）。
于48孔板上选取8孔，每2孔分别对应Th1,Th2,Treg及对照。
每孔500uL培养液，8孔共4 mL。
Th1：加入200倍稀释的IL-12，100倍稀释的Anti-IL-4（10ug/ml）。
Th2：加入50倍稀释的IL-4（20 ng/ml），100倍稀释的Anti-IFN-γ（10 ug/ml）。
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
t细胞效应检测方法
t细胞效应检测方法标题：深入了解T细胞效应检测方法T细胞是人体免疫系统的重要组成部分，负责识别并消灭感染和异常细胞。
在研究和临床实践中，准确检测T细胞的效应功能对于评估免疫状态和疾病进展至关重要。
本文将详细介绍几种常见的T细胞效应检测方法。
一、T细胞增殖实验T细胞增殖实验是检测T细胞功能的一种基础方法。
该实验通常通过以下步骤进行：1.收集待检测的T细胞样本。
2.将T细胞与特异性抗原或刺激剂共同培养。
3.通过细胞计数、放射性标记物摄取或其他检测手段评估T细胞的增殖情况。
二、细胞因子释放实验细胞因子是T细胞活化后分泌的免疫调节蛋白。
通过检测细胞因子的释放，可以评估T细胞的效应功能。
常见的细胞因子释放实验有以下两种：1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过特异性抗体捕获细胞因子，然后进行定量分析。
2.流式细胞术：利用荧光标记的抗体检测细胞因子分泌情况。
三、T细胞杀伤实验T细胞杀伤实验是评估T细胞对靶细胞杀伤能力的方法。
常见的方法有：1.51Cr释放实验：将放射性同位素标记的靶细胞与T细胞共培养，通过测定释放的放射性同位素量来评估T细胞的杀伤能力。
2.非放射性细胞毒性实验：利用荧光染料、钙离子指示剂等代替放射性同位素，评估T细胞对靶细胞的杀伤作用。
四、流式细胞术流式细胞术是一种高精度的细胞检测技术，可以评估T细胞的多种功能，如：1.表型分析：通过检测细胞表面的标记物，了解T细胞的亚群分布和活化状态。
2.细胞内细胞因子染色：检测T细胞内特定细胞因子的表达情况。
五、免疫组化技术免疫组化技术是检测组织中T细胞分布和功能的一种方法。
通过特异性抗体与T细胞表面或细胞内分子结合，然后利用染色剂显色，观察T细胞在组织中的分布和活化状态。
总结：T细胞效应检测方法多种多样，研究人员可以根据实验需求和条件选择合适的方法。
10种常用细胞因子检测方法盘点
10种常用细胞因子检测方法盘点细胞因子是一类在细胞间相互作用中发挥重要作用的蛋白质，对免疫调节、炎症反应、细胞增殖和分化等过程起着关键的调控作用。
因此，检测细胞因子的水平对于研究疾病发病机制、诊断和治疗具有重要意义。
以下是常用的10种细胞因子检测方法盘点：1. 酶联免疫吸附法（ELISA），ELISA是一种常用的细胞因子检测方法，通过将待检测的细胞因子与特异性抗体结合，然后用酶标记的二抗结合，最后通过底物染色来检测细胞因子的含量。
2. 免疫荧光法（IF），IF方法利用激光共聚焦显微镜观察标记的抗体与细胞因子结合的情况，适用于定量和定位分析。
3. 流式细胞术（FCM），FCM结合荧光标记的抗体，可以对多种细胞因子进行快速、高通量的检测和分析。
4. 生物传感器技术，生物传感器技术结合了生物学和传感器学的优势，可以实现对细胞因子的高灵敏度、高选择性检测。
5. 蛋白质芯片技术，蛋白质芯片技术可以同时检测多种细胞因子的含量，具有高通量、高灵敏度的特点。
6. 质谱法，质谱法可以通过检测细胞因子的质荷比来定量和鉴定细胞因子。
7. 生物学功能法，生物学功能法通过观察细胞因子对细胞生物学功能的影响来间接检测细胞因子的活性。
8. 核酸杂交技术，核酸杂交技术可以通过检测细胞因子的mRNA水平来间接反映细胞因子的表达水平。
9. 免疫印迹法（Western blot），Western blot可以用于检测细胞因子的蛋白质水平，结合特异性抗体可以实现对细胞因子的定量分析。
10. 细胞因子生物学活性检测，通过细胞因子对细胞增殖、分化、凋亡等生物学活性的影响来检测细胞因子的活性水平。
以上是常用的10种细胞因子检测方法，它们各自具有特定的优势和局限性，在实际应用中可以根据需要选择合适的方法进行检测分析。
FACS 胞内染色
流式胞内染色实验方法方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。
注意：1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。
2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。
3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。
不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。
4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。
5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
方案A: 两步法胞内（细胞质）蛋白染色实验材料：12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。
实验流程：1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。
缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。
斡旋分散细胞。
3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定细胞。
室温避光孵育20min。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
流式胞内染色步骤
一、surface marker染色
1、收获细胞，用1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
2、加入预先配置好的surface marker抗体混合液（溶于50ul 1%BSA
/PBS），用枪轻轻吹打充分混匀，4度孵育30分钟。
3、1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
二、Intracellular Staining的步骤
1、Fix/permeabilizatioin Buffer（ebioscience）固定破膜剂
2、固定：加入IC Fix/Perm Buffer 100ul 后，混匀，室温孵育20分钟
3、用1x Perm Wash Buffer 1ml洗涤1次（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
4、破膜：加入1x Perm Wash Buffer 1ml，混匀，4度孵育45分钟。
5、离心（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
6、加入细胞因子抗体（溶于50ul 1x Perm Wash Buffer），4度孵育45分钟。
7、最后再用1xPerm Wash Buffer 1ml洗一次，倾倒后，加入适量300ul PBS 重悬细胞。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法细胞因子是一类负责细胞之间相互通讯的蛋白质分子，在生物体中起着重要的调节和调控作用。
细胞因子检测是研究细胞因子功能及其相关疾病机制的重要手段。
本文将介绍常见的细胞因子检测方法，包括免疫学方法、PCR方法以及生物芯片技术。
免疫学方法是常用的细胞因子检测方法之一。
这种方法基于细胞因子与抗原抗体的特异性结合来进行检测。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫荧光法和免疫组化染色法等。
ELISA是最常用的细胞因子检测方法之一。
该方法利用酶标记的抗体与待测的细胞因子特异性结合，通过酶的催化作用使底物发生显色反应，从而进行定量测定。
ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和较大的线性测定范围，广泛应用于临床实验室检测细胞因子水平。
免疫荧光法是通过荧光标记的抗体与待测的细胞因子结合，并通过荧光显微镜观察标记信号来进行检测。
该方法具有高灵敏度和高特异性，可以用于检测细胞因子的定位和分布，广泛应用于生物医学研究中。
免疫组化染色法是一种利用酶标记或荧光标记的抗体与待测的细胞因子结合，并利用酶的催化作用进行染色反应的方法。
通过染色的程度可以判断细胞因子的表达水平及分布情况。
这种方法常用于组织学研究和病理学鉴定中。
PCR方法是一种通过扩增特定DNA序列来进行细胞因子检测的方法。
该方法适用于细胞因子的基因表达研究。
常见的PCR技术包括逆转录PCR、实时荧光定量PCR和单细胞PCR等。
逆转录PCR是一种将RNA转录为cDNA并进行扩增的方法。
该方法通过反转录酶将RNA转录为cDNA，再利用DNA聚合酶扩增所得的cDNA，最终通过凝胶电泳或其它方法来检测细胞因子的基因表达水平。
实时荧光定量PCR是一种可以实时监测DNA扩增过程的PCR方法。
该方法基于荧光信号的累积产生来实时监测扩增产品的数量，从而测量初始模板的绝对量或相对量。
单细胞PCR是一种可以在单个细胞水平检测细胞因子基因表达的PCR方法。
该方法通过将单个细胞在微小反应体系中进行逆转录、扩增和检测，从而实现对细胞因子在单个细胞中的表达水平研究。
胞内因子染色 protocol
BD胞内因子染色操作流程本流程适用的固定破膜试剂盒：实验流程：A.刺激细胞：体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。
多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。
此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28 的抗体）注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。
PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。
1.）使用BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤每6ml细胞培养基中加入4μl BD GolgiStop™并充分混匀。
BD GolgiStop™在培养基中不应超过12小时。
2.）使用BD GolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤每1ml细胞培养基中加入1 μl BD GolgiPlug并充分混匀。
BD GolgiPlug在培养基中不应超过12小时。
BD GolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。
B. 样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色1. 细胞培养用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。
细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。
在染色及储存过程中细胞需避光保存。
2. 阻断Fc受体阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。
a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。
在100μl Staining Buffer（货号：554656）中加入1 μg BD Fc Block/10^6细胞，4°C孵育15分钟。
随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer 适当稀释）。
中文操作手册 胞内因子染色 554715 -3
BD胞内因子染色操作流程本流程适用的固定破膜试剂盒：实验流程：A.刺激细胞：体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。
多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。
此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28 的抗体）注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。
PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。
1.）使用BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤每6ml细胞培养基中加入4μl BD GolgiStop™并充分混匀。
BD GolgiStop™在培养基中不应超过12小时。
2.）使用BD GolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤每1ml细胞培养基中加入1 μl BD GolgiPlug并充分混匀。
BD GolgiPlug在培养基中不应超过12小时。
BD GolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。
B. 样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色1. 细胞培养用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。
细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。
在染色及储存过程中细胞需避光保存。
2. 阻断Fc受体阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。
a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。
在100μl Staining Buffer（货号：554656）中加入1 μg BD Fc Block/10^6细胞，4°C孵育15分钟。
随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer 适当稀释）。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
细胞因子检测的原理和方法概述
细胞因子检测的原理和方法概述细胞因子是一类重要的信号分子，用于细胞间的相互通信和调节。
在生物体内，细胞因子的异常水平与多种疾病的发生和发展密切相关，因此对细胞因子进行检测具有重要的临床和研究意义。
本文将概述细胞因子检测的原理和方法，帮助读者了解这一领域的基本知识。
细胞因子的检测原理主要基于它们在细胞间的相互作用和信号传递过程中所扮演的角色。
细胞因子可以通过多种方式进行检测，其中常见的方法包括免疫学方法、分子生物学方法和生物化学方法等。
免疫学方法是最常用的细胞因子检测方法之一。
其中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是最经典的免疫学方法之一。
ELISA利用酶标记的抗体对目标细胞因子进行定量分析。
这种方法的原理是将待检测的细胞因子与固相抗体结合，然后用酶标记的抗体进行二次结合，最后通过染色反应来测定细胞因子的浓度。
ELISA方法具有高灵敏度和高特异性的优点，广泛应用于临床诊断和疾病监测。
分子生物学方法也被广泛应用于细胞因子的检测。
PCR（聚合酶链反应）是其中最常用的方法之一。
PCR基于DNA合成酶的催化作用，可以快速扩增并检测目标细胞因子的核酸序列。
与ELISA相比，PCR方法具有更高的敏感性和特异性，能够检测到更低浓度的细胞因子。
同时，PCR还可以结合其他分子生物学技术如实时荧光定量PCR来实现更准确的定量分析。
此外，生物化学方法也可用于细胞因子的检测。
其中较常用的方法是质谱法。
质谱法基于细胞因子的质量-电荷比，利用质谱仪分析待测细胞因子的分子结构和质量。
质谱法具有高分辨率和高准确性的优点，能够对细胞因子进行精确的定量分析。
总结起来，细胞因子检测的原理和方法多种多样，常见的方法包括免疫学方法、分子生物学方法和生物化学方法等。
这些方法具有不同的特点和优势，可以根据具体需求选择适合的方法进行细胞因子的检测。
细胞因子的准确检测有助于早期发现疾病、评估疾病的严重程度以及指导治疗方案的制定，对于临床医学和生物研究具有重要意义。
细胞因子检测方法
整理版ppt
31
整理版ppt
32
检测原理
细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因 子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被 捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其 后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。底物孵 育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明 细胞产生了细胞因子，通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。
整理版ppt
26
整理版ppt
27
免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
整理版ppt
28
ELISPOT
Enzyme-linked Immunospot Assay
整理版ppt
29
整理版ppt
30
ELISPOT发展历史
1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。
整理版ppt
24
细胞培养和刺激的基本方法
细胞内细胞因子的流式检测讲解
刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断 ：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
胞内细胞因子染色分析艾滋病人CD4 +T淋巴细胞Th1／Th2漂移
ｏ ｌ ｅｌｒｓｄ ｇａ ｕａｌ ｎ ｈ ｖ ｒ ｅ ｐ ｒｅ ｔｏ ｈ ｅｌｐ ｒｅ ｔｄ ｓｅ ｄ ｄ ｏ ｖｏ ｓｙ Ｔｈ ｒ ｏ ｓｇ ｉ ｃ ｔｄｆ ｒｎｃ ｓｂ ｔ ｅ ｆＴｈ ｃ ｌ ｉ ｒｄ ｌ ａ ｄ ｔｅ ａ ｅａ ｅｃ ｎ ｆＴ ２ ｃ ｌ ｅｃ ｎ ｅ ｃ ｎ ｅ ｂ ｉｕ ｌ ｅ ｙ ｇ ｅｅ ｎ ｉｎ ｆ ａ ｉｅ ｅ ｅ ｅｗｅ ｎ ｉｎ
ｔｅｐ ｒｅ ｔ ｆ ｈ ｅ１ａｄｔｅａ ｙｔ ｆ ８ｗ ｅ ｓｗ ｓｏ ｓｒｅ ｒ ．４ ｈ ｅｃｎ ２ ｅｌ ｎ ｈｒｐ ｉ ｏ ｅ ｋ ａ ｂｅ ｄ（ ＝０ ８ ７，Ｐ ：０ ０ ６） Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｉｔ ｅｌ ａ ｙ ｋｎ ｏＴ ｍｅ ６ ｖ １ ． ｎ ｌｓｏ ｎｒ ｅ ｕ ｒｅｔ ｉｅ ａ ｌ ｌ ｏ
Ａｐｐｙｎｇ ｉ ｒ ｃ ｌｕａ ｙ ｏ ｎ ｔ ｉｉ ｏ ｎ ｌ ｓｓ ｏ Ｍ Ｔ ｅｌ ｌｉ ｎｔａ ｅｌ ｌｒ ｃ ｔ ｋｉｅ ｓａｎｎｇ ｆｒ ａ ａ ｙ ｉ ｆ ＣＩ ｃｌ Ｔｈｌ ／Ｔｈ ｂ ｌｎｃ ｈｆ ｎ ２ ａａ ｅ ｓ ｉｔ ｉ ＡＩ ＤＳ ａ ｉｎｔ Ｗ ＡＮＧ ｐ ｔｅ ｓ．
维普资讯
中 国热 带 医学 ２０ ０７年 第 ７卷 第 ｌ ０期
Ｃ ＩＡ Ｔ Ｏ ＩＡ ＤＣＮ ｏ． ｏｊ ｃ ｂｒ ０ ７ ＨＮ Ｒ ＰＣ ＬＭＥ ＩＩＥ Ｖ１７Ｎ ．０Ｏ ｔ ｅ２ ０ ｏ
１ ３ ７ ７
［ 论
著］
胞 内细胞 因子 染色 分析 艾滋 病人 Ｃ ４ Ｔ淋 巴细胞 Ｔ １Ｔ ２ 移 Ｄ＋ ｈ ／ｈ 漂
ｔｅｐ ｒｅ ｔ ｆ ｈ ｅ ｎ ｅａ ｙｔ ｆ ８ ｗ ｅ ｓｗ ｒ ｂｅｖｄ ｒ ｈ ｅｃｎ ｌｃｌ ａｄ ｔ ｒｐ ｍｅｏ ｅｋ ｅｅｏ ｓｒｅ （ ：０．４ ，Ｐ ＝０．５ ） ｏＴ ｈ ｉ ６ ７１ ０ ７ ．Ｗｈｌ ｉ ｉｃ ｎ ｉｅｅ ｃ ｅ ｅｎ ｉ ｓ ｎｆ ａ ｔ ｆ ｒｎ ｅｂｔ ｅ ｅ ｇｉ ｄ ｗ
流式细胞检测实验方法篇
流式细胞检测实验方法篇流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。
一、细胞表面染色步骤1. 样本准备①采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓）用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。
对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。
②加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
2. 红细胞裂解①需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。
将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育3-5分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步。
②加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
③重复洗涤一次，加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
④细胞计数，用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。
将100μL细胞悬液加入流式管中备用。
3. 封闭Fc受体封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。
①小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。
加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。
胞膜和胞内抗原如何同时标记
胞膜和胞内抗原如何同时标记胞膜和胞内抗原同时标记的具体步骤如下:1 膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量抗凝骨髓（或其他类型）标本，充分混匀后室温避光孵育15min2 溶血：加入1XFACS溶血素2ml，低速涡流混匀，室温避光静置8-10min3 洗涤：弃去上清，加入1ml PBS洗液，300g离心洗涤5min4 透膜与固定：用透膜剂处理，固定细胞膜并使其通透。
在此介绍两种透膜剂的使用方法：BD FACS和CALTAG 透膜剂。
BDFACS透膜剂的使用：加入500ul透膜剂，低速涡流混匀，温室作用10min，加1ml PBS，300g离心300min。
CALTAG透膜剂的使用：加入100ul透膜剂A液，低速涡流混匀，室温作用15min，加PBS 1ml，300g离心5min，弃去上清，加入100ul透膜剂 B液，同时加入相应的荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育15min。
5 细胞内抗原染色：加入相应的荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育30min（CALTAG透膜剂省去此步骤）6 洗涤：弃去上清，加入1ml含有1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，300g离心洗涤5min。
7 上机检测：弃去上清后加入PBS 200ul，上机检测。
如不能及时上机检测，则加入0.5ml 1%多聚甲醛，混匀后置于4°冰箱内保存后检测。
值得注意的是，在标记ckappa和clambda时，在标记细胞前先用无血清PBS洗涤3遍，然后进行跑膜抗原标记、溶血、洗涤、胞内抗原标记和洗涤、上机检测。
（1）细胞内细胞因子的测定细胞因子在细胞系统调节中起着非常重要的作用，常用检测方法是以分泌后释放至外部环境的细胞因子检测为基础，一般来说选用酶联免疫吸附实验ELISA或放射免疫分析法RIA，虽然敏感且可以定量，但测定的是每单位体积中细胞总体分泌的平均细胞因子水平。
为了界定产生某种细胞因子的细胞类别、表型、层顶实际产生细胞因子的细胞数量或比例，有必要寻找新的方法检测单细胞内的细胞因子。
免疫学技术在病毒性肝炎中的应用(二)
长的孵育时间。尽管可见光照射能把溴化乙锭共价结合于核酸 ，但产生的平均荧光强度相对 低。Ｐ ｏ ｉｉｍ ｉｄｄ ｒｐ ｕ ｏ ｉｅ染色强 ，故难补偿 ７ 氨基放线菌素（ ｎ ａｔ ｏ ｃ ） ｄ 一 ａ ｏ ｃ ｎ ｍｙ ｉ ，其发光谱几 ｍｉ ｉ ｎ 乎不与藻红蛋白发光谱重 叠 ，因为 ７ 氨基放线菌素荧光弱而容易补偿。然而还应该考虑到的 一
殖， 由于 Ｂ细胞和 Ｃ ８ Ｄ Ｔ细胞也能针对重组的病毒蛋白和／ 或其分解产物发生增殖应答反应。 基于流式细胞仪的分析 方法如 Ｃ Ｓ Ｆ Ｅ和基于溴脱氧尿苷（ｒｍｏ ｅｏ ｙ ｒ ｉｅ ｂｏ ｄｓｘ ｕ ｉ ｎ ） ｄ 的增殖应答反
与会者达成的共识是用流式细胞术检测细胞内因子时不够敏感难以在体外检测 ＨＣ 感 Ｖ 染时低频率的 ＨＣ 特异性 Ｔ细胞 ，但急性丙肝除外。这项技术有助于用抗原一 Ｖ一 特异性 Ｔ细
胞系 ・ “ 去卷曲”识别多肽混合物并且分析应答反应是否由 Ｃ ４ Ｃ Ｓ Ｄ 或 Ｄ Ｔ细胞所介导 。在相应 的细胞因子分泌实验中 ，用一种特异的试剂把分泌的细胞因子 固定于分泌该细胞因子的细胞 表面 ， 另一优点是分泌细胞因子的细胞可通过磁珠进行阳性选择并进一步培养或克隆 。 其
是鉴定活化细胞有用的标记物且也可作为细胞内染色和抑制蛋白分泌的阳性对照。当检测细 胞内 Ｔ Ｆ 【 ，除 了莫能星外，还需布雷 菲德菌素 Ａ，因为莫能星不能完全阻断 Ｔ Ｆ ０ Ｎ 一０ 时 Ｎ 一【
分泌 。
正如在 Ｅ Ｉｐ ｔ ＬＳ ｏ 方法中报告的 ， 用新鲜的细胞和冻存／ 复苏的细胞有较好的相关性 。 ３ 在 ７
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞内细胞因子染色
胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂
I. 抗体
1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)
2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)
注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替
II. 其他材料：
1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)
2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)
3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.
4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)
5. Ionomycin (Sigma I9657)
仪器
1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)
步骤
1. 刺激细胞：
1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞
2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。
（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）
2. 收集细胞:
1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞
2) 收集细胞用PBS.重悬两次
3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL
4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)
5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋
6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋
3. 细胞表面抗原染色
1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。
2) 用100μl表面抗体混合液重悬（推荐稀释倍数：1:100 PBS/2% FBS）。
室温避光孵育20分钟，离心。
3) 预冷PBS洗一遍
4. 细胞内抗原染色
1) 200μlBD Cytofix/CytoPerm溶液重悬。
室温避光孵育30min，500 x g, 3 minutes, 4℃离心
2) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心
3) 用100μl 细胞因子染液重悬 (推荐稀释倍数: 1:100 in 1X Perm/Wash). 冰上避光孵育,30 mini按12步离心.
4) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心
5) 用 300-400μl FACS buffer 重悬细胞并转移到 Falcon 圆底试管中用用流式细胞仪操作。
参考文参:
1. Eur. J. Immunol. 1994 24:1097-1101.
2. Clin Cancer Res 2004 10(20):6946-5。