细胞内细胞因子染色

细胞内细胞因子染色

胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。

材料和试剂

I. 抗体

1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)

2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)

注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替

II. 其他材料：

1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)

2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)

3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.

4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)

5. Ionomycin (Sigma I9657)

仪器

1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)

步骤

1. 刺激细胞：

1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞

2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）

2. 收集细胞:

1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞

2) 收集细胞用PBS.重悬两次

3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL

4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)

5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋

6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋

3. 细胞表面抗原染色

1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。

2) 用100μl表面抗体混合液重悬（推荐稀释倍数：1:100 PBS/2% FBS）。室温避光孵育20分钟，离心。

3) 预冷PBS洗一遍

4. 细胞内抗原染色

1) 200μlBD Cytofix/CytoPerm溶液重悬。室温避光孵育30min，500 x g, 3 minutes, 4℃离心

2) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心

3) 用100μl 细胞因子染液重悬 (推荐稀释倍数: 1:100 in 1X Perm/Wash). 冰上避光孵育,30 mini按12步离心.

4) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心

5) 用 300-400μl FACS buffer 重悬细胞并转移到 Falcon 圆底试管中用用流式细胞仪操作。

参考文参:

1. Eur. J. Immunol. 1994 24:1097-1101.

2. Clin Cancer Res 2004 10(20):6946-5