细胞内细胞因子染色

细胞内细胞因子染色
胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。

通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。

通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。

材料和试剂
I. 抗体
1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)
2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)
注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替
II. 其他材料：
1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)
2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)
3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.
4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)
5. Ionomycin (Sigma I9657)
仪器
1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)
步骤
1. 刺激细胞：
1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞
2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。

（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）
2. 收集细胞:
1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞
2) 收集细胞用PBS.重悬两次
3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL
4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)
5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋
6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋
3. 细胞表面抗原染色
1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。

2) 用100μl表面抗体混合液重悬（推荐稀释倍数：1:100 PBS/2% FBS）。

室温避光孵育20分钟，离心。

3) 预冷PBS洗一遍
4. 细胞内抗原染色
1) 200μlBD Cytofix/CytoPerm溶液重悬。

室温避光孵育30min，500 x g, 3 minutes, 4℃离心
2) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心
3) 用100μl 细胞因子染液重悬 (推荐稀释倍数: 1:100 in 1X Perm/Wash). 冰上避光孵育,30 mini按12步离心.
4) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心
5) 用 300-400μl FACS buffer 重悬细胞并转移到 Falcon 圆底试管中用用流式细胞仪操作。

参考文参:
1. Eur. J. Immunol. 1994 24:1097-1101.
2. Clin Cancer Res 2004 10(20):6946-5。