细胞内因子的流式检测
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细胞内细胞因子的流式检测
基本概念
细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子 抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合， 即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。
Th1细胞分泌IFN-g、IL-2、TNF-a Th2细胞分泌IL-4;IL-5;IL-10
技术优势
➢ 快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需68小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便
➢ 刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择 PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的 CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长， 4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
➢ 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMC ➢ 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统 ➢ 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根
据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分 析 ➢ 安全：减少样本处理与生物源性污染 ➢ 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映 了体内状况
②表面结合的细胞因子的阻断：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体， 阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
➢ 荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
所需试剂
1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如CD3、CD4、CD8、CD25等
2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等
3、溶血素：裂解红细胞 4、激活剂：
如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子
所需试剂
5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚 集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细Fra Baidu bibliotek因子的能力。
注意事项
➢ 选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少应该设置以下对照：
①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过 程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
②激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到 CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不 当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。
一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。
一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
③同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的 免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
注意事项
➢ 使用适当细胞表面阻断试剂，减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
①Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在 小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
操作步骤
➢细胞表面抗原染色 ➢刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA） ➢固定、破膜 ➢细胞因子染色
注意事项
➢ 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会
限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。血样在8小时内分析，超过8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在 8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
基本概念
细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子 抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合， 即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。
Th1细胞分泌IFN-g、IL-2、TNF-a Th2细胞分泌IL-4;IL-5;IL-10
技术优势
➢ 快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需68小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便
➢ 刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择 PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的 CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长， 4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
➢ 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMC ➢ 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统 ➢ 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根
据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分 析 ➢ 安全：减少样本处理与生物源性污染 ➢ 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映 了体内状况
②表面结合的细胞因子的阻断：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体， 阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
➢ 荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
所需试剂
1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如CD3、CD4、CD8、CD25等
2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等
3、溶血素：裂解红细胞 4、激活剂：
如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子
所需试剂
5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚 集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细Fra Baidu bibliotek因子的能力。
注意事项
➢ 选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少应该设置以下对照：
①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过 程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
②激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到 CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不 当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。
一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。
一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
③同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的 免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
注意事项
➢ 使用适当细胞表面阻断试剂，减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
①Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在 小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
操作步骤
➢细胞表面抗原染色 ➢刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA） ➢固定、破膜 ➢细胞因子染色
注意事项
➢ 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会
限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。血样在8小时内分析，超过8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在 8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。