细胞因子检测PPT
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细胞内因子的流式检测(共10张PPT)
所需试剂
1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如CD3、CD4、CD8、CD25等
2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等
3、溶血素：裂解红细胞
4、激活剂：
如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子
所需试剂
5、阻断剂
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细胞免疫检测I细胞因子的检测.ppt
实验三 细胞免疫检测I： 细胞因子的检测
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之（从细胞因子的角 度考虑
方案归纳
人体免疫包括细胞免疫和体液免疫。本次 实验从T细胞分泌的细胞因子着手检测细胞 免疫功能。
确定研究对象，给药途径，剂量，样本量。 给药后检测血清中细胞因子的含量。
竞争法 双抗体夹心法 改良双抗体夹心法 抑制性测定法 抗体夹心法
抑制性测定法
间接法测抗体
本次实验操作步骤
每孔加用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的IL-2 抗体，4℃过夜。
封闭：用10%小牛血清封闭，37℃孵育20 分钟，洗涤3次。
于每孔内分别加不同稀释度（如1:5，1:10， 1:20…1:80）的待测血清，PBS空白对照， 阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。 37℃孵育30分钟，洗涤3次
金免疫技术
金免疫技术的特点是以胶体金作为示踪标 记物 ，应用于抗原抗体反应的一种新型免 疫标记技术。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法是当前应用最广泛的免疫检测方法。 本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化 作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变 化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏 感度可达ng水平。
免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫分析法放射免疫分析法酶联免疫分析法酶联免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法金标记技术金标记技术免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记的抗体或抗原与组织或细胞中的相应的抗体或抗原与组织或细胞中的相应抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体的方法
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附 法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者 主要测定可溶性抗原或抗体。
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之（从细胞因子的角 度考虑
方案归纳
人体免疫包括细胞免疫和体液免疫。本次 实验从T细胞分泌的细胞因子着手检测细胞 免疫功能。
确定研究对象，给药途径，剂量，样本量。 给药后检测血清中细胞因子的含量。
竞争法 双抗体夹心法 改良双抗体夹心法 抑制性测定法 抗体夹心法
抑制性测定法
间接法测抗体
本次实验操作步骤
每孔加用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的IL-2 抗体，4℃过夜。
封闭：用10%小牛血清封闭，37℃孵育20 分钟，洗涤3次。
于每孔内分别加不同稀释度（如1:5，1:10， 1:20…1:80）的待测血清，PBS空白对照， 阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。 37℃孵育30分钟，洗涤3次
金免疫技术
金免疫技术的特点是以胶体金作为示踪标 记物 ，应用于抗原抗体反应的一种新型免 疫标记技术。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法是当前应用最广泛的免疫检测方法。 本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化 作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变 化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏 感度可达ng水平。
免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫分析法放射免疫分析法酶联免疫分析法酶联免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法金标记技术金标记技术免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记的抗体或抗原与组织或细胞中的相应的抗体或抗原与组织或细胞中的相应抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体的方法
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附 法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者 主要测定可溶性抗原或抗体。
细胞因子(Cytokines,CKs ) PPT课件
因
子 NK细胞分泌的细胞因子——IFNγ
T细胞
T细胞 NK细胞
IL-2 IFN- TNF-
IFN-
细胞因子的同源性与多源性
二、细胞因子的分类和命名
白细胞介素（interleukin，IL-1~30） 干扰素（interferon，INF-I/II） 肿瘤坏死因子
（tumor necrosis factor,TNFα/β） 集落刺激因子
IL-1，IL-6，IFN，TNF，趋化因子(IL-8)
作用
诱导急性期蛋白产生（acute phase protein） 刺激下丘脑体温调节中枢产生发热反应 趋化并活化中性粒细胞，介导天然免疫和炎症反应
参与免疫应答和免疫调节
• 参与免疫应答的细胞因子
IFN，IL-2——参与细胞免疫应答 IL-4，IL-5，IL-6——参与体液免疫应答 TNF——参与细胞免疫应答的效应阶段
应用单克龙抗体统一分类和命名的白细胞 分化抗原
CD分子是细胞的表面标志又具有重要的功能
作为免疫细胞标志的CD分子
TCR-CD3 —— 全T细胞标志 CD4 —— CD4+T细胞标志 CD8 —— CD8+T细胞标志
BCR,CD19,CD21 —— B细胞标志
CD56、D16 —— NK细胞标志
T细胞亚群及其功能
细胞因子（Cytokines，CKs ）
• ——由多种细胞分泌 的一群具有广泛生物 学活性的小分子蛋白质的统称。其中包括 淋巴因子和单核因子。
•淋巴因子（lymphokine）—由淋巴细胞分 泌的细胞因子 •单核因子（monokine）—由单核巨噬细胞 分泌的细胞因子
细胞因子及其受体概述
一、细胞因子的来源和分布
齐鲁医学细胞因子.pptx
CD27、 CD30、 CD40、 CD134、 CD137/4-IBB、 LNGFR、TRAMP、DR2、 DR4、DR5、DcR2、DcR1、 OPG
2021/7/27 星期二
25
2021/7/27 星期二
26
趋化因子受体超家族(ChRsF)
结构特征 属于有7个穿膜区的G蛋白偶联受体 G-binding protein coupled receptor,G-PCR)。 又称7个穿膜区受体超家族。
2021/7/27 星期二
32
细胞因子的主要生物学效应
2021/7/27 星期二
33
1、抗感染和抗肿瘤作用 2、免疫调节作用、 3、参与细胞凋亡 4、刺激造血细胞增埴分化 5、促进各种细胞的生长和分化 6、参与和调节炎症反应 7、细胞因子异常可导致疾病的发生
2021/7/27 星期二
34
细胞因子与临床
29
MCP-1,3
细胞因子受体共同链
两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或 多聚体形式，包括一特异性配体结合（链, 低 亲和力受体）和一个参与信号转导链（ 链， 高亲和力受体）。
2021/7/27 星期二
30
IL-2受体
IL-2受体由3条肽链组成，包括 （CD25）、（CD122）、（CD132）
14
❖肿瘤细胞
如Jurkat细胞、骨髓瘤细胞等。
❖基因工程技术
从工程细胞如大肠杆菌、酵母菌等产生重 组细胞因子。
2021/7/27 星期二
15
细胞因子结构与功能特点
2021/7/27 星期二
16
1、 小分子蛋白，单链或双链，多含糖基 2、量微而活性强 3、通过与细胞因子受体结合而发挥效应 4、旁分泌(paracrine)或自分泌(autocrine）
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趋化因子受体超家族(ChRsF)
结构特征 属于有7个穿膜区的G蛋白偶联受体 G-binding protein coupled receptor,G-PCR)。 又称7个穿膜区受体超家族。
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32
细胞因子的主要生物学效应
2021/7/27 星期二
33
1、抗感染和抗肿瘤作用 2、免疫调节作用、 3、参与细胞凋亡 4、刺激造血细胞增埴分化 5、促进各种细胞的生长和分化 6、参与和调节炎症反应 7、细胞因子异常可导致疾病的发生
2021/7/27 星期二
34
细胞因子与临床
29
MCP-1,3
细胞因子受体共同链
两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或 多聚体形式，包括一特异性配体结合（链, 低 亲和力受体）和一个参与信号转导链（ 链， 高亲和力受体）。
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IL-2受体
IL-2受体由3条肽链组成，包括 （CD25）、（CD122）、（CD132）
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❖肿瘤细胞
如Jurkat细胞、骨髓瘤细胞等。
❖基因工程技术
从工程细胞如大肠杆菌、酵母菌等产生重 组细胞因子。
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细胞因子结构与功能特点
2021/7/27 星期二
16
1、 小分子蛋白，单链或双链，多含糖基 2、量微而活性强 3、通过与细胞因子受体结合而发挥效应 4、旁分泌(paracrine)或自分泌(autocrine）
细胞因子(共84张PPT)
二、干扰素（interferon, IFN）
1. 1957年发现 2. 广谱抗病毒作用 3. 间接杀伤或抑制病毒，通过与细胞表面受体
作用使细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒的复 制
4. 可增强NK、巨噬细胞和T淋巴细胞的活性，
发挥免疫调节作用
（一）分型（根据其来源、结构及生物学性质）
1. I型 IFN-α、IFN-β （1）细胞来源
重叠性：几种不同的细胞因子作用于同一靶细胞，产 生相同或相似的生物学效应（如IL-4和IL-6 均刺激B细胞增殖）
协同性：两种或两种以上的细胞因子共同作用，并
且一种细胞因子强化另一种细胞因子的功
能，两者表现为协同作用，如IL-3和IL-11
共同刺激造血干细胞的分化成熟。
拮抗性：一种细胞因子抑制另一种细胞因子的功 能。（如IL-4－－IFN-γ）
（1）局部低浓度 激活T细胞、激活巨噬细胞。 （2）大量产生 内分泌效应：诱导肝脏急性期蛋
白合成；引起发热和恶病质。
（二）IL-6
1. 细胞来源 主要由单核-巨噬细胞、Th2细胞、 血管内皮细胞、成纤维细胞产生。
2. 主要功能 （1）刺激活化B细胞增殖，分泌抗体； （2）刺激Ｔ细胞增殖及CTL活化； （3）刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反 应； （4）促进血细胞发育。
2. 细胞来源：单核巨噬细胞（主要）；
肥大细胞。
T细胞、NK细胞和
3. 主要功能
(1) 低浓度 --- 自分泌、旁分泌效应 1) 诱导炎症反应： ①旁分泌：使血管内皮细胞表达ICAM-1，促白细胞聚集 于炎症局部； ②自分泌：刺激单核巨噬细胞等合成、分泌细胞因
子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等)，导 致炎性细胞浸润和增强吞噬细胞的杀伤。
细胞因子检测方法ppt课件
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
检测方法的进展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
夹心ELISA
缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同 一性和频率性的直接信息
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
检测方法的进展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
夹心ELISA
缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同 一性和频率性的直接信息
6第六章--细胞因子PPT课件
二、细胞因子的共同特性
①受抗原、丝裂原等刺激后由细胞分泌产生，多为小分子。 ②对靶细胞作用通常无抗原特异性。在较低浓度下即有生物学
活性。 ③通过与靶细胞表面受体结合发挥作用。 ④以自分泌、旁分泌和内分泌的形式发挥作用。 ⑤一种细胞因子可由多种细胞产生，一种细胞也可产生多种细
胞因子；一种细胞因子可作用于多种类型细胞（多效性）， 多种细胞因子也可作用于同一种靶细胞（重叠性）；一种细 胞因子可抑制其他细胞因子的功能（拮抗性），一种细胞因 子可增强另一种细胞因子的功能（协同性）；细胞因子在体 内相互调节，形成复杂的细胞因子网络。
（四）诱导细胞凋亡
IL-2可诱导抗原活化的T细胞发生凋亡； TNF可诱导肿瘤细胞的凋亡。
（五）促进创伤的修复
第四节 细胞因子受体
一、细胞因子受体（CKR）分类: 膜结合型细胞因子受体（mCKR） 可溶性细胞因子受体（sCKR）
(一)免疫球蛋白基因超家族
如IL-1R、IL-6R、M-CSFR、SCFR
1.淋巴因子（lymphokine）淋巴细胞分泌 2.单核因子（monokine）单核巨噬细胞分泌 3.其他细胞分泌的细胞因子
干扰素治疗急性乙型肝炎
患者Gerald M.Edelman，男，35岁.主诉:因近日胃口 欠佳、乏力、反复出现头晕、肝区不适而入院。
患者入院前，自感全身乏力、萎靡、食欲不振，并有恶心、 呕吐、头晕、失眠、巩膜、皮肤出现黄染入院。患者自述6 年前体检发现HBsAg阳性，未作任何治疗。入院后，体格 检查：肝肿大于肋下1cm、压痛，左肋下可触及脾脏；实验 室检查：谷丙转氨酶升高，诊断为急性乙型肝炎。住院后经 用拉米夫定、肝泰乐、维生素等抗病毒和护肝药物治疗两个 半月，病情仍未明显好转；根据患者病情迁延不愈，医生随 即在原用药的基础上，使用干扰素抗病毒治疗（500万U/ 次），使用干扰素四个月后，病人自感觉状态好转，使用干 扰素抗病毒治疗6个月，患者血清谷丙转氨酶转正常， HbsAg转阴性，病人痊愈出院。 问题：1、为什么使用干扰素能治愈“乙肝”？干扰素有哪些特 点？2、除干扰素外细胞因子还有哪几大类？其理化性质和 作用特点如何？
细胞因子医学PPT课件
12
8 网络效应
CK的产生、生物学作用、受体表 达、相互调节等均具有网络性。
13
14
9 CK与激素、神经肽和神经递质共 同组成细胞间信号分子系统
15
三、 细胞因子的种类
白细胞介素 干扰素 肿瘤坏死因子 集落刺激因子 趋化因子 生长因子
interleukins，ILs interferon，IFN tumor necrosis factor，TNF colony stimulating factor，CSF chemokines growth factor，GF
44
五 干扰素（抗病毒）生物活性的研究方法
原理：用干扰素样品处理易感细胞，使细胞建立抗病 毒状态，然后用适当的定量病毒攻击细胞，通过病毒 复制的量或病毒引起的细胞病变程度可判断样品中干 扰素的生物活性。
45
常用细胞株
WISH（人羊膜细胞 ）、MDBK（牛肾细胞 ）、L929 （小鼠肺纤维瘤） 、Hep2/c（人喉癌细胞） 要求：易培养,对病毒敏感性高,易于诱导抗病毒状态, 对人体无害
7
(作用方面特性)
4 高效性 10-12mol/L
5 主要以自分泌（autocrine）、旁分泌（paracrine） 形式发挥效应
某些细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）也可以内分泌 （endocrine）形式作用于远端靶细胞,介导全身性 反应。
某些ck还可以通过细胞内分泌（intracrine），直接与 细胞内受体结合。
30
抗原提呈？
抗原提呈：是指抗原提呈细胞(antigen-presenting cell， APC)摄取抗原并将其处理成免疫原性多肽，以 抗原肽-MHC分子复合物的形式表达于APC表面，供T细 胞识别，从而产生免疫应答的过程。
8 网络效应
CK的产生、生物学作用、受体表 达、相互调节等均具有网络性。
13
14
9 CK与激素、神经肽和神经递质共 同组成细胞间信号分子系统
15
三、 细胞因子的种类
白细胞介素 干扰素 肿瘤坏死因子 集落刺激因子 趋化因子 生长因子
interleukins，ILs interferon，IFN tumor necrosis factor，TNF colony stimulating factor，CSF chemokines growth factor，GF
44
五 干扰素（抗病毒）生物活性的研究方法
原理：用干扰素样品处理易感细胞，使细胞建立抗病 毒状态，然后用适当的定量病毒攻击细胞，通过病毒 复制的量或病毒引起的细胞病变程度可判断样品中干 扰素的生物活性。
45
常用细胞株
WISH（人羊膜细胞 ）、MDBK（牛肾细胞 ）、L929 （小鼠肺纤维瘤） 、Hep2/c（人喉癌细胞） 要求：易培养,对病毒敏感性高,易于诱导抗病毒状态, 对人体无害
7
(作用方面特性)
4 高效性 10-12mol/L
5 主要以自分泌（autocrine）、旁分泌（paracrine） 形式发挥效应
某些细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）也可以内分泌 （endocrine）形式作用于远端靶细胞,介导全身性 反应。
某些ck还可以通过细胞内分泌（intracrine），直接与 细胞内受体结合。
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抗原提呈？
抗原提呈：是指抗原提呈细胞(antigen-presenting cell， APC)摄取抗原并将其处理成免疫原性多肽，以 抗原肽-MHC分子复合物的形式表达于APC表面，供T细 胞识别，从而产生免疫应答的过程。
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dissociated production of IFN- and GzB
HIV- peptide recall patient B
Medium
Cytokine network
wLwOwG.thOemegallery.
wLwOwG.thOemegallery.
wLwOwG.thOemegallery.
CBA原理示意图
wLwOwG.thOemegallery.
cytokine bead arrays(CBA)
Lab Invest 2003, 83:1131–1146
wLwOwG.thOemegallery.
ELISPOT(酶联免疫斑点实验)
ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分 泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（spot）是激活 的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单 细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。
高通量细胞因子检测
❖CBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合 来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养 液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的 量。其采用夹心法分析策略，与传统的 ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测 多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线 就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不 受样本量的限制，而且可以得到一个样本的 多个数据。
Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)
Chromium-51 (51Cr) release ys
细胞
微孔 滤膜 趋化因子
计数受趋化细胞
趋化实验示意图
免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗 原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可 见的或可测定的。
37ºC，24-48小 观察细胞病变（时镜检或比色）
Using CFSE to track CML progenitor proliferation
SDM
SDM + Glivec
Calculation of Proliferative Index (P.I.)
43210
CFSE ---> The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.
细胞因子的检测方法
左大明 zdaming@
细胞因子
一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分子蛋白，参与免疫调节 和多种生理病理过程等。
白细胞介素(interleukin, IL) 干扰素(interferon, IFN) 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) 生长因子(growth factor, GF) 趋化因子(chemokine)
与过敏机制之细胞因子的研究 传 染 疾 病 研 究 --Lyme disease, Chlamydia infections,
Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等
HIV-peptide specific recall response shows
细胞因子的检测方法
生物学检测法 免疫学检测法
1
不同的 CK具有不同的 生物学活性，选择 CK 独特的生物学活性，即 可检测。
细胞增殖/抑制实验 细胞病变抑制实验 细胞毒实验 细胞趋化实验 。。。
优点：敏感、可靠； 缺点：需长期饲养细 胞、检测耗时长、步 骤繁杂。
2
利用抗体对抗原表位的 识别，测定的是可溶性 细胞因子的抗原性。
优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可检测到百万分之 一阳性细胞率; 单细胞水平、活细胞功能检测; 操作简便，可进行高 通量筛选。
ELISPOT
1.特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭能结合单抗的其他部位；
3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞 分泌的细胞因子被单抗捕获；
4.移出细胞，洗涤；
ELISA RIA FIA ELISPOT 。。。
优点：方便、迅速 缺点：价格昂贵，结 果仅代表CK的量而非 活性，敏感性较低。
分子生物学检测法
3
利用基因探针，检测特 定细胞因子基因表达， 即mRNA水平。
斑点杂交 Northern印迹 细胞和组织原位杂交 RT-PCR 。。。
局限性：仅能检测基因表 达情况，不能直接提供有 关细胞因子的浓度和活性 ，只用于机制探讨。
细胞增殖实验
待检样品(细胞上清) 指示细胞（CTLL-2） IL-2依赖细胞系
按不同稀 释度加入
37ºC，16-20小时
加入3HTdR（1-5Ci
）
37ºC，4-6小时
收集细胞
测定
细胞病变抑制实验
待检样品（细胞上清） IFN-指示细胞（wish ）
按不同稀 释度加入
37ºC，4小时 弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)
5.加入生物素标记的二抗；
6.加入酶标链霉亲和素；
7.加入显色底物，在酶的催化分解下 ，产生不可溶的色素，就近沉淀在 局部的膜上形成斑点；
8.斑点计数（可人工计数，也可用自 动读板仪计数），数据处理，结果 分析。
应用
移植研究--allograft rejection 疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 Th0/Th1/Th2细胞转换分析 自体免疫研究--免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究--肿瘤反应T细胞作用 过敏机制探讨--IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参
HIV- peptide recall patient B
Medium
Cytokine network
wLwOwG.thOemegallery.
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CBA原理示意图
wLwOwG.thOemegallery.
cytokine bead arrays(CBA)
Lab Invest 2003, 83:1131–1146
wLwOwG.thOemegallery.
ELISPOT(酶联免疫斑点实验)
ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分 泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（spot）是激活 的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单 细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。
高通量细胞因子检测
❖CBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合 来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养 液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的 量。其采用夹心法分析策略，与传统的 ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测 多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线 就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不 受样本量的限制，而且可以得到一个样本的 多个数据。
Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)
Chromium-51 (51Cr) release ys
细胞
微孔 滤膜 趋化因子
计数受趋化细胞
趋化实验示意图
免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗 原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可 见的或可测定的。
37ºC，24-48小 观察细胞病变（时镜检或比色）
Using CFSE to track CML progenitor proliferation
SDM
SDM + Glivec
Calculation of Proliferative Index (P.I.)
43210
CFSE ---> The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.
细胞因子的检测方法
左大明 zdaming@
细胞因子
一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分子蛋白，参与免疫调节 和多种生理病理过程等。
白细胞介素(interleukin, IL) 干扰素(interferon, IFN) 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) 生长因子(growth factor, GF) 趋化因子(chemokine)
与过敏机制之细胞因子的研究 传 染 疾 病 研 究 --Lyme disease, Chlamydia infections,
Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等
HIV-peptide specific recall response shows
细胞因子的检测方法
生物学检测法 免疫学检测法
1
不同的 CK具有不同的 生物学活性，选择 CK 独特的生物学活性，即 可检测。
细胞增殖/抑制实验 细胞病变抑制实验 细胞毒实验 细胞趋化实验 。。。
优点：敏感、可靠； 缺点：需长期饲养细 胞、检测耗时长、步 骤繁杂。
2
利用抗体对抗原表位的 识别，测定的是可溶性 细胞因子的抗原性。
优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可检测到百万分之 一阳性细胞率; 单细胞水平、活细胞功能检测; 操作简便，可进行高 通量筛选。
ELISPOT
1.特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭能结合单抗的其他部位；
3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞 分泌的细胞因子被单抗捕获；
4.移出细胞，洗涤；
ELISA RIA FIA ELISPOT 。。。
优点：方便、迅速 缺点：价格昂贵，结 果仅代表CK的量而非 活性，敏感性较低。
分子生物学检测法
3
利用基因探针，检测特 定细胞因子基因表达， 即mRNA水平。
斑点杂交 Northern印迹 细胞和组织原位杂交 RT-PCR 。。。
局限性：仅能检测基因表 达情况，不能直接提供有 关细胞因子的浓度和活性 ，只用于机制探讨。
细胞增殖实验
待检样品(细胞上清) 指示细胞（CTLL-2） IL-2依赖细胞系
按不同稀 释度加入
37ºC，16-20小时
加入3HTdR（1-5Ci
）
37ºC，4-6小时
收集细胞
测定
细胞病变抑制实验
待检样品（细胞上清） IFN-指示细胞（wish ）
按不同稀 释度加入
37ºC，4小时 弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)
5.加入生物素标记的二抗；
6.加入酶标链霉亲和素；
7.加入显色底物，在酶的催化分解下 ，产生不可溶的色素，就近沉淀在 局部的膜上形成斑点；
8.斑点计数（可人工计数，也可用自 动读板仪计数），数据处理，结果 分析。
应用
移植研究--allograft rejection 疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 Th0/Th1/Th2细胞转换分析 自体免疫研究--免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究--肿瘤反应T细胞作用 过敏机制探讨--IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参