细胞因子染色方案(中)
流式胞内染色—刺激剂与蛋白转运抑制剂的选择
流式胞内染色—刺激剂与蛋白转运抑制剂的选择
流式实验应用中，除了常见的表面抗原染色，还会进行胞内因子检测，比如：常见的细胞因子：IFN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF；核内转录因子：FOXP3、GATA3、STAT5；胞内信号通路相关蛋白：MAPK家族(AKT、P38、JNK、ERK) 等。胞内染色步骤相对复杂，涉及的变异因素多，很容易出现结果不稳定、较难重复等问题。absin®给大家推荐流式胞内染色过程中常使用到的刺激剂和蛋白转运抑制剂。
一般情况下，静息状态的T、B细胞不产生或极低产生细胞因子，多数细胞因子必须在T细胞激活后才能分泌产生，所以必须采用体外激活来刺激细胞因子的表达。流式胞内染色中最常用的活化方法就是使用一定浓度的广泛性刺激剂：PMA (佛波酯) 和lonomycin (离子霉素)，刺激细胞4-6 h (可优化)。
PMA和lonomycin刺激细胞活化的机制：在细胞内，Protein kinase C(PKC) 的激活，可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致多种蛋白的表达引起细胞的活化。PKC可以在DAG (二酯酰甘油) 和Calcium (Ca2+) 的共同作用下被激活，PMA是一种DAG的模拟物，lonomycin 是Ca2+的转运剂，可将细胞器内的Ca2+转运到胞浆，所以PMA和lonomycin的共同作用可以激活PKC，从而引起一系列的下游反应。
产品推荐：
刺激后的细胞不能直接进行流式检测，细胞因子会分泌到胞外影响实验结果，还需要加入阻断剂，将细胞因子阻断在胞内，有助于细胞因子的聚集使胞内染色信号增强，提高检出率，所以这一步
细胞因子的检测方法
细胞因子的检测方法
细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白
物质的统称。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调整、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是
基础免疫讨论的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观看、疗效
推断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。
但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来
困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采纳
的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异
较大，给临床诊断与治疗带来肯定的困难。因此，有必要了解各种
检测方法的特性及影响因素。
目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类一.生物学检测法
生物学检测又称生物活性检测，是依据细胞因子特定的生物活性
而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促
进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci 激造血细胞集落形成，IFN爱护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活
性，即可对其进行检测。生物活性检测法又可分为以下几类：
1．细胞增殖法
很多细胞因子具有细胞生 zhang 因子活性，特殊是白细胞介素，
如IL-2 ci激t细胞生 zhang 、IL-3 ci 激肥大细胞生 zhang 、
IL-6 ci 激浆细胞生 zhang 等。利用这一特性，现已筛选出一些对
特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依靠于某种因子的细胞系，即依靠细胞株(简称依靠株)。这些依靠株在通常状况下不能存活，
只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依靠株ctll-2在不含
细胞因子检测方法
检测试剂）：100μl的U-Cytech无血清培养基 设置2-4个孔的重复
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ELISPOT标准操作程序 D2
以前做的封闭，可加入200μl的U-Cytech无血清培养 基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次
① Brefeldin-A(BFA)：10mg/ml．在激活过程最后4-5小时使 用BFA ，过度孵育会导致细胞活力下降
② Monensin：3uM
http://www.cytometry.cn/files/FLOWapplicaion/TH1TH2/brefeldin%2
0a.pdf
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倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在 灭菌的吸水纸上扣干
200μl试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C 封闭1小时
倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培 养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次， 拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数 周。）
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ELISPOT标准操作程序 D2
测定
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3
生物分析法
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4
（一）依赖性细胞株
一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能 在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDCPL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于 人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细 胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高， 特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都 能找到相应的细胞株，因而限制了它的应用。
细胞因子的检测和应用详解演示文稿
TaqMan技术
P O CH2 o
5’端标记报告荧光
没有杂交 ，距离近 而发生荧 光能量转 移
OH 3’端标记淬灭荧光
TaqMan
聚合酶
样本中原始模板的数量与荧光强度超出选定阈
值时的扩增循环数（Ct)成反比
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“分子信标”技术
• 生长因子（grow factor）GF
• 趋化因子
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细胞因子检测
细 靶趋
ELISA
胞 增 殖
细化
胞 杀 伤
活 性
诱 导 产 物
变细 抑胞 制病
流 式 细 胞 技 术
术受 体 检 测 技
DNA RNA 检测
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生物学检测法
(1)细胞增殖法 • 依赖细胞株：许多细胞因子具有细胞生长因子
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靶细胞滤液
3~5μm孔径的微孔滤膜
受检的趋化因子
３７℃ 温育数小时 取膜固定、干燥、着染、脱色
将透明后的滤膜置油镜下检测细胞在 膜内通过距离，求其趋化单位
滤膜微孔小室法
现在是14页\一共有41页\编辑于星期日
趋化因子或待测 液
细胞悬液
细胞内细胞因子染色
细胞内细胞因子染色
胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂
I. 抗体
1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)
2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)
注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替
II. 其他材料：
1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)
2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)
3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.
4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)
5. Ionomycin (Sigma I9657)
仪器
1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)
步骤
1. 刺激细胞：
1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞
FACS 胞内染色
流式胞内染色实验方法
方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。
注意：
1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。
2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。
3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。
4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。
5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
方案A: 两步法胞内（细胞质）蛋白染色
实验材料：
12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。实验流程：
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
细胞内细胞因子染色
细胞内细胞因子染色
胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂
I. 抗体
1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)
2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)
注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替
II. 其他材料：
1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)
2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)
3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.
4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)
5. Ionomycin (Sigma I9657)
仪器
1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)
步骤
1. 刺激细胞：
1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞
细胞内因子的流式检测
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
注意事项
➢ 选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少应该设置以下对照：
①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过 程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
②激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到 CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不 当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
操作步骤
➢细胞表面抗原染色 ➢刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA） ➢固定、破膜 ➢细胞因子染色
注意事项
➢ 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会
限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。血样在8小时内分析，超过8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在 8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
细胞内因子的流式 检测
基本概念
细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子 抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合， 即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。
Th1细胞分泌IFN-g、IL-2、TNF-a Th2细胞分泌IL-4;IL-5;IL-10
技术优势
➢ 快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-
流式胞内细胞因子检测
流式胞内细胞因子检测
I.导言
单细胞胞内细胞因子分析方法在持续不断改进中，分析技术包括ELISPOT，原位杂交(in situ hybridization)，免疫组织化学(immunohistochemistry)，有限稀释分析和单细胞PCR等。相比较流式细胞术是一种强大的分析技术，可以同时分析单个细胞的多个参数，包括大小和粒度，以及由荧光抗体表征的表面和细胞内标记物的表达。
胞内细胞因子和趋化因子对应的荧光标记单克隆抗体应用已经非常成熟，也适用于混合细胞群内胞内染色和多色分析。表面和胞内相结合的多色免疫荧光染色提供了一种高分辨率方法，用于鉴定表达特定细胞因子的细胞的性质和频率。已经有非常多的应用案例如细胞因子表达受限制的（如，Th4与Th2样）或不受限制的（如，Th0）各种细胞类型的分析。除了能够同时对单个细胞进行高特异性和高灵敏的多个参数同时测量外，该方法还能够快速收集大量细胞信息，进行统计学意义上的分析。
胞内细胞因子的染色取决于细胞因子特异性单克隆抗体的鉴定，及其与固定-透化过程的相容性。已经报道了使用多聚甲醛固定和用去污剂皂苷对细胞膜透化的组合的最佳细胞内细胞因子染色。多聚甲醛固定允许保持细胞形态和细胞内抗原性，同时还使细胞能够承受去污剂的透化作用。皂苷的膜透化使细胞因子特异性单克隆抗体穿透内质网和高尔基体的细胞膜，胞质溶胶和膜。
细胞因子染色的关键参数包括：细胞类型和激活方案-活化后细胞收获的时间-细胞活化过程中包含蛋白质转运抑制剂-和抗细胞因子抗体的选择等。
II.一般方法
A.刺激细胞
胞内因子染色 protocol
BD胞内因子染色操作流程
本流程适用的固定破膜试剂盒：
实验流程：
A.刺激细胞：
体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，
以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28 的抗体）
注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。
1.）使用BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤
每6ml细胞培养基中加入4μl BD GolgiStop™并充分混匀。BD GolgiStop™在培养基中不应超过12小时。
2.）使用BD GolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤
每1ml细胞培养基中加入1 μl BD GolgiPlug并充分混匀。BD GolgiPlug在培养基中不应超过12小时。BD GolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。
B. 样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色
1. 细胞培养
用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。在染色及储存过程中细胞需避光保存。
2. 阻断Fc受体
阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。
a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。在100μl Staining Buffer（货号：554656）中加入1 μg BD Fc Block/10^6细胞，4°C孵育15分钟。随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer 适当稀释）。
细胞因子检测方法
检测试剂）：100μl的U-Cytech无血清培养基 设置2-4个孔的重复
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ELISPOT标准操作程序 D2
以前做的封闭，可加入200μl的U-Cytech无血清培养 基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次
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ELISPOT标准操作程序 D3
培养后操作
倾倒孔内的细胞及培养基，低渗法将细胞裂解：每孔 加200μl冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟
200μl的PBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒 扣在吸水纸上拍干
避免反复冻融 。使用前将标本平衡至室温， 不能用水浴锅 细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除 细胞和细胞残渣。
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注意事项
试剂盒贮存条件和有效期 未开封试剂盒：贮存在2-8℃ 开封/复溶试剂 ：2-8℃可以1个月左右 标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
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细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
细胞因子技术方法
易操作 样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进 行快速、客观的分析
应用领域
B细胞杂交瘤的筛选 化合物和药物免疫学反应的检测 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 靶向疫苗的质控 自身免疫疾病的诊断和预后分析 自身免疫疾病免疫治疗的监控 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 器官移植中排斥反应的预测 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 结核病的诊断
第1步，包被捕获抗体到96孔板中， BSA阻断后加入标准品或者标本
第2步，加入酶标的抗体，结合被捕 获的细胞因子
第3步，加入酶的底物显色，酶标 仪或者化学发光议读取结果
第4步，绘制标准曲线，计算标本中 细胞因子的含量
技术优势
检测细胞因子的传统方法
操作较简便，无需昂贵的仪器设备
可供选择的品种齐全
IL-1（血清）↑--- 慢性血清病、免疫复合物肾病等 sIL-2R（血清）↑--- 白血病、多发性硬化、 AIDS、移植排斥反应等
治疗
治疗方式： A. 细胞因子补充疗法 B. 细胞因子阻断疗法 （1）治疗炎症反应
IFN-α：疱疹性角膜炎、乙型肝炎等 IL-10：类风湿性关节炎
（2）治疗恶性肿瘤
IL-2 ：肾细胞癌、黑色素瘤 IL-1～8、IL-10、IL-12、G-CSF、IFN-α、IFN-γ、TNF-α等(转基因)： 多 种肿瘤。
（3）治疗自身免疫性疾病
中文操作手册 胞内因子染色 554715 -3
BD胞内因子染色操作流程
本流程适用的固定破膜试剂盒：
实验流程：
A.刺激细胞：
体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，
以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28 的抗体）
注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。
1.）使用BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤
每6ml细胞培养基中加入4μl BD GolgiStop™并充分混匀。BD GolgiStop™在培养基中不应超过12小时。
2.）使用BD GolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤
每1ml细胞培养基中加入1 μl BD GolgiPlug并充分混匀。BD GolgiPlug在培养基中不应超过12小时。BD GolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。
B. 样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色
1. 细胞培养
用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。在染色及储存过程中细胞需避光保存。
2. 阻断Fc受体
阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。
a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。在100μl Staining Buffer（货号：554656）中加入1 μg BD Fc Block/10^6细胞，4°C孵育15分钟。随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer 适当稀释）。
细胞因子检测的原理和方法概述
细胞因子检测的原理和方法概述
细胞因子是一类重要的信号分子，用于细胞间的相互通信和调节。在生物体内，细胞因子的异常水平与多种疾病的发生和发展密切相关，因此对细胞因子进行检测具有重要的临床和研究意义。本文将概述细胞因子检测的原理和方法，帮助读者了解这一领域的基本知识。
细胞因子的检测原理主要基于它们在细胞间的相互作用和信号传递过程中所扮
演的角色。细胞因子可以通过多种方式进行检测，其中常见的方法包括免疫学方法、分子生物学方法和生物化学方法等。
免疫学方法是最常用的细胞因子检测方法之一。其中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是最经典的免疫学方法之一。ELISA利用酶标记的抗体对目标细胞因子
进行定量分析。这种方法的原理是将待检测的细胞因子与固相抗体结合，然后用酶标记的抗体进行二次结合，最后通过染色反应来测定细胞因子的浓度。ELISA方
法具有高灵敏度和高特异性的优点，广泛应用于临床诊断和疾病监测。
分子生物学方法也被广泛应用于细胞因子的检测。PCR（聚合酶链反应）是其
中最常用的方法之一。PCR基于DNA合成酶的催化作用，可以快速扩增并检测目
标细胞因子的核酸序列。与ELISA相比，PCR方法具有更高的敏感性和特异性，
能够检测到更低浓度的细胞因子。同时，PCR还可以结合其他分子生物学技术如
实时荧光定量PCR来实现更准确的定量分析。
此外，生物化学方法也可用于细胞因子的检测。其中较常用的方法是质谱法。
质谱法基于细胞因子的质量-电荷比，利用质谱仪分析待测细胞因子的分子结构和
质量。质谱法具有高分辨率和高准确性的优点，能够对细胞因子进行精确的定量分析。
细胞内因子染色
文章编号:1007-8738(2005)S -0062-03
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
钱 莘综述 施 明,王福生3审阅(解放军第302医院生物治疗研究中心,北京100039)
收稿日期:2004-05-07; 修回日期:2004-07-05作者简介:钱 莘(1979-),女,陕西西安人,硕士生.
3Corres ponding author,Tel:(010)66933332
Email:fs wang@public .bta .net .cn
[关键词] 细胞内细胞因子;流式细胞术[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A
细胞因子作为细胞间信号传导的分子,主要介导和调节免疫应答及炎症反应,刺激造血细胞生成和组织损伤的修复等。正常情况下,细胞因子的表达和分泌受到机体严格地调控。在病理状态下,细胞因子会出现异常表达。因此,检测细胞因子对于某些疾病的诊断、治疗具有重要价值。当前,仅对细胞进行定量及活性检测已不能满足需要,在单细胞水平研究细胞因子的表达更加重要。随着流式细胞术(fl ow
cyt ometry,FC M )在临床、科研中的广泛应用,利用FC M 与细
胞内细胞因子(intracellular cyt okine,I CK )染色技术相结合,可提供一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法[1]。本文主要就FC M 检测I CK 的研究进展作一综述。
1 FC M 检测I CK 的基本原理
用FC M 检测I CK 是通过体外多克隆激活剂,如佛波酯
(phorbol 2122m irystate 2132acetate,P MA )和离子霉素(i onomy 2cin )或特定的抗原激活细胞,同时用莫能霉素(monensin,MN )或布雷菲德菌素A (brefeldin A,BF A )阻断胞内高尔基体
细胞因子检测方法
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免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
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ELISPOT
Enzyme-linked Immunospot Assay
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ELISPOT发展历史
1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。
倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在 灭菌的吸水纸上扣干
200μl试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C 封闭1小时
倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培 养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次， 拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数 周。）
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ELISPOT标准操作程序 D2
避免反复冻融 。使用前将标本平衡至室温， 不能用水浴锅 细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除 细胞和细胞残渣。
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注意事项
试剂盒贮存条件和有效期 未开封试剂盒：贮存在2-8℃ 开封/复溶试剂 ：2-8℃可以1个月左右 标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
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胞内细胞因子染色
1.细胞刺激完成后，移去大部分上清液，加200ulFACS或MACS buffer，轻轻混匀。设计细
胞染色的排放位置并记录，根据设计把细胞转移至染色板里，2000rpm,离心2min，甩去上清，在吸水纸上轻轻拍干，使用的位置不可重复利用(下同)。
2.死细胞染色。加200ul PBS，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min；重复洗涤1次。此步骤的
目的为洗去培养基中残留的蛋白质。Dead/Live dye (Violet (BV421 channel), Aqua (BV510 channel), or Zombie Yellow (BV570 channel)用PBS 1:1000稀释，每孔加50 ul，轻轻混匀，避光，室温染色30 min。然后每孔加200ulFACS buffer，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min。
3.表面染色。
A.配制表面染色抗体mix。根据染色方案计算每个抗体加入量，将抗体按照既定的稀
释比例溶于FACS buffer里，每个抗体加过后需标记，防止加错。使用前吹打混匀。
B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。避光，人细胞室温染色15min；小鼠细胞
4℃染色10min。
C.染色后，洗去未结合的多余抗体。加入200ul FACS buffer 轻轻吹打，2000rpm, 2min
离心，甩去上清。
D.如果使用Biotin偶联的抗体，配制Streptavidin-dye至工作浓度。每孔50ul,轻轻吹打
后，4℃避光染色10min。染色结束后加FACS buffer 200ul,2000rpm, 2min离心，甩去上清。
4.固定破膜。（BD）
A.每孔加入50ul固定破膜液(BD CytoFix/Perm)，轻轻吹打混匀。避光固定破膜4℃，
20min。
B.配制Perm Wash。10X浓缩液稀释为1X，即1份浓缩液加9份灭菌水。
C.固定破膜完成后，洗涤2次。第1次洗涤每孔加入150ul Perm Wash,轻轻吹打，
2000rpm, 2min离心，甩去上清；第2次洗涤每孔加入200ul Perm Wash，,轻轻吹打，2000rpm, 2min离心，甩去上清。
5.胞内染色。
A.配制胞内抗体mix。抗体按既定稀释比例溶于Perm Wash里，使用前轻轻吹打混匀。
B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。避光，4℃染色30min。
C.染色后，洗去未结合的多余抗体。加入200ul Perm Wash轻轻吹打，2000rpm, 2min
离心，甩去上清。共洗2次。
D.如果使用Biotin偶联的抗体，应用Perm Wash配制Streptavidin-dye。每孔50ul,轻轻
吹打后，4℃避光染色10min。染色结束后洗涤，Perm Wash 200ul,1500rpm,3min离心，甩去上清。共洗2次。
6.重悬过滤。
A.每孔加入200ul FACS buffer，轻轻吹打重悬。
B.用40um滤膜过滤到FACS管里，视细胞量多少，体积可做适当调整，一般为300-500
ul。
注意事项：
1.操作过程中细胞吹打要轻柔。
2.染色也可于EP管内进行。EP管离心500g, 2min。
3.抗体置于冰上，抗体mix配制时，注意用灭菌枪头，不要污染管内抗体。配好后避光4℃
保存。