引物合成常规问题

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Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'-O H的保护基团D M T，获得游离的5'-O H；

(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-O H发生耦合反应；

(3) 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；

(4)氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。Q2.引物合成后如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、O P C、P A G E和H P L C。定量：根据寡核苷酸在260n m处的紫外吸收来定量。储存：分装抽干。

Q3.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度级别要求一般P C R扩增<60b a s e H E P D >60b a s e P A G E 诊断P C R扩增<40b a s e H E P D,P A G E D N A测序20b a s e左右H E P D 亚克隆，点突变等根据实验要求定H E P D,P A G E，H P L C 基因构建（全基因合成）根据实验要求定H E P D P A G E 反义核酸根据实验要求定H E P D P A G E 修饰引物根据实验要求定P A G E,H P L C Q4.引物的质量是不是跟序列有关四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者，国内公司一般

都做不了20个G以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d（G）都能得到同样的非常好的结果。Q5.需要合成多少O D数根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1O D就足够了。Q6.如何计算引物的浓度引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V(微升)=O D数x33x10000/引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1O D260=33u g/m l。Q7.如何计算引物的T m值引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。

长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，T m计算公式为：T m=+x L o g10[N a+]+(G C%)–600/s i z e＊＊公式中，S i z e=引物长度。

Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(N m o d*W m o d)＋(N x*W x)+(N I*W I)+16*N s–62. NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A 混合的分子量为（+）/2 = 。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。常规碱基分子量

B a s e M o l e c u l a r W e i g h t

常规修饰基团分子量

5’-B i o t i n3’-T A M A R A 5’-(6F A M)3’-D a b s y l 5’-H E X3’-(6F A M) 5’-T E T3’-A m i n o M o d i f i e r C 3 5’-C y53’-A m i n o M o d i f i e r C7 5’-C y33’-T h i o l M o d i f i e r C 3

Q9.如何溶解引物？干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的p H值比较低（p H4-5）,引物在这种条件下不稳定。Q10.如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。干粉：运输时常温运输，-20℃可以保存一年。储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃可以保存半年。工作液：常规使用，4℃保存，也可-20℃保存，但应避免反复冻融。修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。Q11.最长可以合成多长的引物我们合成过100base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base 的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高

主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一

般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的

原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。

Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体

上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效

果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，

退火时需要提高退火温度。

Q14.为什么引物的O D260/O D280小于

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过

低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体引物的

OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

B a s e

C o m p o s i t i o n A260/280

5-A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A- 3 5-G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G- 3 5-C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C- 3

5-T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T- 3 5-A A A A A G G G G G T T T T T C C C C C- 3

Q15.同样的O D用P A G E检测，E B染色为什么深浅不一

通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双

链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB

的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。

所以不要用E B染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。

Q16.如何检测引物的纯度

实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电

泳。取的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热

变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V

电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带

型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染

色。

Q17.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris 缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析

常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

高层建筑结构设计常见问题探讨

高层建筑结构设计常见问题探讨摘要：近年来，建筑高度的不断增加, 风格的变化多样，给高层结构设计提出了新的课题和挑战。本文就结构设计中特别要注意的几个问题进行了分析。关键词：高层建筑; 结构设计;常见问题一、高层建筑结构设计特点 1 高层建筑结构设计的特点 1.1 水平荷载成为决定因素。一方面，因为楼房自重和楼面使用荷载在竖向构件中所引起的轴力和弯矩的数值，仅与楼房高度的一次方成正比；而水平荷载对结构产生的倾覆力矩，以及由此在竖向构件中引起的轴力，是与楼房高度的两次方成正比；另一方面，对某一定高度楼房来说，竖向荷载大体上是定值，而作为水平荷载的风荷载和地震作用，其数值是随结构动力特性的不同而有较大幅度的变化。 1.2 轴向变形不容忽视。高层建筑中，竖向荷载数值很大，能够在柱中引起较大的轴向变形，从而会对连续梁弯矩产生影响造成连续梁中问支座处的负弯矩值减小，跨中正弯矩和端支座负弯矩值增大；还会对预制构件的下料长度产生影响，要求根据轴向变形计算值对下料长度进行调整；另外对构件剪力和侧移产生影响，与考虑构件竖向变形比较，会得出偏于不安全的结果。 1.3 侧移成为控制指标。与较低楼房不同，结构侧移已成为高层建筑结构设计中的关键因素。随着楼房高度的增加，水平荷载下

结构的侧移变形迅速增大，因而结构在水平荷载作用下的侧移应被控制在某一限度之内。 1.4 结构延性是重要设计指标。相对于较低楼房而言，高层建筑结构更柔一些，在地震作用下的变形更大一些。为了使结构在进入塑性变形阶段后仍具有较强的变形能力，避免倒塌，特别需要在构造上采取恰当的措施，来保证结构具有足够的延性。二、根据不同类型高层建筑，选择合理的结构体系 2.1结构的规则性问题新旧规范在这方面的内容出现了较大的变动，新规范在这方面增添了相当多的限制条件，例如：平面规则性信息、嵌固端上下层刚度比信息等，而且，新规范采用强制性条文明确规定“建筑不应采用严重不规则的设计方案”。因此，结构工程师在遵循新规范的这些限制条件上必须严格注意，以避免后期施工图设计阶段工作的被动。 2.2结构的超高问题在抗震规范与高规中，对结构的总高度都有严格的限制，尤其是新规范中针对以前的超高问题，除了将原来的限制高度设定为a 级高度的建筑外，增加了 b级高度的建筑，因此，必须对结构的该项控制因素严格注意，一旦结构为 b级高度建筑甚或超过了b 级高度，其设计方法和处理措施将有较大的变化。在实际工程设计中，出现过由于结构类型的变更而忽略该问题，导致施工图审查时未予通过，必须重新进行设计或需要开专家会议进行论证

引物设计基本方法

Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。最后说一句，敢于尝试就会成功。第二贴－－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。－－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。－－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。－－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。－－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。－－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。谈一下我学这个引物设计的过程吧：

DNA合成常见问题解答

DNA合成常见问题解答 1.DNA合成粗产物中含有什么杂质 DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。 2.如何进行合成产物的纯化目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种： A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5' 端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。 B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5' 端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25 碱基以上的片段纯化效果不好。 C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人

居住区景观设计常见问题及解决措施

居住区景观设计常见问题及解决措施摘要：本文主要阐述了居住区景观的概述，分析了居住区景观设计的特点以及遵循的原则，以及居住区景观设计常见的问题，针对这些问题提出了切实可行的措施。然而，在分析居住区景观设计的问题时，要从不同的角度出发，在现代居住区环境设计中充分彰显生态性、空间多样性以及整体性等特点，以期对居住区景观设计有所助益。关键词：居住区景观设计；问题；解决措施当前人居环境的一个非常重要的组成部分那就是居住环境，居住环境担负着为人类提供舒适的居住生活的任务，与此同时也担负着一定的社会功能。近几年来，随着社会经济的快速发展，人们的居住消费意识在进一步提高，由此，居民对居住的要求越来越高，居民开始从仅仅关注户型平面转向关注小区的整个环境以及外部空间设计。所以，很多开发商抓住购房者的心理，纷纷打造出“景观牌”，以此吸引大众的眼球。一、居住区景观的概述工业革命爆发于十八世纪下半叶，在此次革命爆发之后就带来了城市形态的变革，人口开始涌入城市，这就增加了城市的人口数量，并且也打破了传统的城市格局。在有一些城市中出现了大片的工业区、商贸区以及住宅区，并且城市结构以及规模也在不断发生变化。与此同时城市人口的不断增多，这就涌现出较多的城市居住条件恶化等问题。为了能够解决城市发展过程中的问题，城市理论就应运而生。在二十世纪二十年代，城市开始摆脱了传统古典主义的束缚，并且开始向着功能主义形体花的方向发展。二、居住区景观设计的特点及遵循的原则 2.1居住区景观设计的特点居住区景观设计的特点如下：其一，将城市的土地充分利用起来。合理规划场地成为城市居住区景观设计的根本问题。在居住区的景观设计中要根据居住区内的住宅用地、公共建筑用地来确定设计方案。其二，注重居住区景观的功能性。在设计居住区景观的时候，要充分考虑到美化环境，还要考虑到环境功能。好的景观设计应该充分利用有限的土地空间，并且还要赋予其更多的功能，比如：儿童游戏空间、健身空间等。其三，明确空间立意。景观设计应该与居住区建筑设计整体风格的主题保持一致。 2.2居住区景观设计遵循的原则居住区景观设计应该遵循的原则如下：点线面相结合的原则。在整个环境设计中，最精彩的地方就是景观中的点，这些点元素通过相互交织的道路等线性元

DNA电泳常见问题分析

DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项 1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。 4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。 7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。 11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。 12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量 DNA电泳常见问题分析之一 1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。一个让PAGE胶很快聚合的方法：不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。 2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？ 1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm

楼梯设计常见问题探讨(一)

21 We learn we go 张伟，李斌，黄杰/0 前言楼梯间的功能是解决建筑物竖向交通，对多层和高层建筑而言，都是不可或缺的重要组成部分。当遇到紧急情况（如火灾、地震等）时，楼梯间是紧急疏散人群的重要交通通道，其重要性更突出。在对工业与民用建筑工程项目进行设计时，楼梯间是最能体现建筑师和结构工程师密切配合的劳动成果。在满足楼梯间建筑功能正常使用的前提下，做到安全经济，是结构工程师最基本的职责。但是，若欠缺有关的设计经验，不但会影响到楼梯间正常使用和建筑功能的要求，而且有时会遗留安全隐患。楼梯间设计正确与否的问题涉及到与建筑专业的配合深度，而且针对结构专业自身也存在一些需要注意的常见问题，故基于在实际工程中大量工程案例有关楼梯设计问题的归类和总结，通过一些常见问题的剖析，提出解决问题的思路和方法，供同行在实际工程设计中借鉴。 1 影响建筑功能的问题 1.1 净高不足（1）存在问题楼梯间净高不足是楼梯设计中常见问题之一，出现此类问题的原因主要有以下两点：1）建筑师对相关建筑规范中有关楼梯设计的规定尚未熟练掌握或对组成楼梯结构构件的空间关系缺乏必要了解；2）结构工程师对楼梯净高概念的要求未能融会贯通、灵活应用，对影响到净高结构构件的空间关系缺乏足够认识。（2）应对措施 1）掌握有关楼梯净高概念的相关规定，《民用建筑设[1]第6.7.5条规定：楼梯平台上部及下部过道处的净高不应小于2m ，梯段净高不宜小于2.2m 。其中，对梯段净高的概念解释为：自踏步前缘（包括最低和最高一级踏步前缘线以外0.3m 范围内）量至上方突出物下缘间的垂直高度。上述解释的理由是基于一般应满足人在楼梯上伸至手臂向上旋升时手指刚触及上方突出物下缘一点为限，为保证人在行进时不碰头和不产生压抑感，故按照常用楼梯坡度，梯段净高不宜小于2.2m 。2）对遇到梯段净高余量较小的区域，上层踏步起跑位置的梯梁位置应仔细计算分析，遇到净高不足的情况，有两个途径可以选择：即取消起跑位置梯梁或将梯梁内退平移。前者适用于梯段和休息平台跨度之和较小的情况，此时该梯段转化为折线型楼梯，应重新复核计算，其梯板板厚和配筋均会有所变化。后者应特别注意，梯梁内退平移距离应将建筑面层厚度计算在内，以免余量太小，有可能仍旧不满足对梯段净高的要求。遇到休息平台下方净高余各项因素，将上层位置的梯梁内退0.35m ，可有效解决该问题（图1）。图1 梯段净高不足实例一（4）工程实例2 某工程楼梯间，首层入户门和半层位置均存在净高不足的问题，针对此问题，采取的具体措施为：入户门上方梯梁设计为反梁可使得净高大于2m 。半层位置梯段休息平台和起跑位置净高余量均较小，除将梯梁内退0.35m 外，尚要求梯梁梁高控制在0.3m 以内，方能满足最小净高的要求（图2）。 1.2 净宽不足（1）存在问题

引物设计原则(必看)

mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能

PCR常见问题分析报告及对策

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低

6.循环次数过多对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物

的交*污染对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非

阐述当今景观设计存在的问题

阐述当今景观设计存在的问题 2016级刘梦婕当前，随着社会经济日益完善与发展，我国城市建设的发展步伐取得了显著的进步，加上近年来人们生活水平的日益提升，使得人们对于社会生活环境的要求也不断的提高。在近几年社会发展中，人们普遍关注城市绿化与城市生存环境等方面的问题。其中。景观设计能够有效地提升我国城市的居住环境，对于城市化建设的发展具有一定的促进作用。通过城市园林景观设计，能够有效地为人类提供一个健康舒适的生存环境。在进行城市园林景观设计的过程中，需要从实际情况出发，考虑周围环境等方面。此外，园林景观的设计要与时代发展相协调，进一步有效推进城市建设在社会发展中有效地进行。然而，在当前，我国城市园林景观设计中依旧存在诸多的问题，导致了城市化建设无法得到有效的实施，为了有效解决园林景观设计中存在的问题，需要从实际情况进行分析研究，制定出相关的策略，进而有效提高我国景观的设计，为人们创建出健康舒适的生存环境，为城市发展提供大力的支持。 1.现代居住区景观发展现状近些年来我国的经济得到了高速发展，人们逐渐脱离了物质生活的局限，越来越关注精神产品，对景观设计的要求也大幅提高。虽然近年来我国加大了对环境的改善力度，但是还存在很多问题，例如，有的小区没考虑到特殊人群的特有需要导致设施不足，有的过于追求形式，设计大面积纯观赏性绿化而忽视人的参与，有的景观风格缺少协调，照搬外来文化等。此外，由于我国有关环境设计理论方面发展较为缓慢，再加上一些开发商为了降低成本，聘用一些专业素质不高的设计人员，使得一些居住小区景观设计出现了许多问题。例如，许多设计人员在不探究西方人文历史的情况下盲目追求欧式景观园林风格。也有的设计人员搞不清中式和欧式的区别，仅凭感觉、经验进行设计，造成景观设计毫无内涵。 2..当今景观设计存在的问题 2.1景观设计的模式缺乏创新良好的景观设计应能充分体现其特有风格和地方特色，并可充分体现区域内文化底蕴及历史内涵。随着当今社会经济的迅猛发展与时代的进步．我国城市化建设的进程也随之加快。在我国城市建设中．城市规划是一项重要的任务。景观设计在城市规划中占据核心作用。景观的设计能够充分地反映出一个城市的美观度。根据上述分析可知．景观设计需要具有一定的创造性和个性化．需要通过相关的设计风格充分地体现出一所城市的精神面貌。也就是说，景观设计需要发挥出其独特的设计风格。通过这种设计能够体现出城市的美观。然而．近年来．我国景观设计过程中缺乏个性化和创造性．通常是模仿国外园林设计的方式进行城市建设，进而无法表现出自身的特性．无法将城市文化底蕴深深地进行体现。景观的建设在当前社会发展中缺乏创新性、个性化的设计风格和设计理念城．需要进行进一步的完善与改进。 2.2景观设计过程中缺乏长远的规划合理有效的景观设计，对于全面推进城市建设具有一定的促进作用和极其深远的意义。然而，在近年来，城市建设的发展由于受到诸多因素的干扰，无法达到理想的效果，主要的原因是进行景观设计过程中，设计者对于城市发展的意识程度不够到位、缺乏专业性的设计理念，有时没有清楚其意识到景观设计对于城市化建设和人们生存环境改造的重要意义。因此，无

琼脂糖凝胶电泳常见问题分析

DNA凝胶电泳简介一、实验原理 DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

对建筑结构设计常见问题探讨

对建筑结构设计常见问题探讨发表时间：2018-11-09T17:57:33.430Z 来源：《建筑学研究前沿》2018年第19期作者：秦浩 [导读] 设计工作需要由多工种多专业合作共同完成，因此结构设计工作不是孤立的。山东建大工程鉴定加固研究院山东济南 250000 摘要：结构设计简而言之就是用结构语言来表达建筑师及其它专业工程师所要表达的东西。用基础，墙，柱，梁，板，楼梯，大样细部等结构元素来构成建筑物的结构体系，包括竖向和水平的承重及抗力体系。把各种情况产生的荷载以最简洁的方式传递至基础。关键词：房屋建筑；结构设计；常见问题设计工作需要由多工种多专业合作共同完成，因此结构设计工作不是孤立的。在设计方面，就需要与建筑设计或工艺设计、设备设计及建筑经济等工种紧密配合；在设计以外，它又跟很多专业，如结构材料、施工技术、分析理论和计算工具、检测手段等密切相关，因此，要提高结构设计水平，除做好自身工作以外，不管是正常的设计工作或者科学研究，都要取得这些工种与专业的支持。不要把结构设计工作自闭起来，应该认识到它的成果或者提高是与其他工种和专业的支持分不开的。 1.地基与基础方面 1.1对于独栋或单体数量较少的住宅，建设单位能委托地质勘察单位进行详细的地质勘察，能为工程设计提供较为详细的勘察技术资料，而成片的多层房屋建筑往往因为地勘费用的问题，地勘单位的探点不能严格按照有关技术要求布置，多栋建筑单体参考一个探点，使得实际的地质情况与地勘报告相差较大。地基与基础设计要做到合理、安全适用，设计人员必须依据详细、真实的地质勘察资料。 1.2软弱地基处理一般采用级配砂石换填，仅仅简单提出换填深度和最终地基承载力的要求，在技术上只是草草写上严格执行《地基处理规范》，而没有针对具体的建筑物画出详细的开挖边线，如轴线变化处，突出凹进墙体部分的开挖边线等，也没有明确砂石换填的应力扩散角具体数值。因此很多工程在地基基础施工中，不能切实有效地做好地基处理。 1.3在基础设计中，对于混凝土独立基础、筏板基础、条形基础，节点设计、构造设计中往往不明确应采用的具体技术参数，如锚固长度搭接长度是采用抗震的还是非抗震的，造成具体实施阶段的扯皮现象 1.4在高层混凝土结构的主体结构设计中，往往梁柱混凝土的等级差别较大，那么在梁柱节点处混凝土怎么进行处理，在设计图中往往不作清楚地技术交底。梁柱节点本身就是个受力复杂的节点，而由于设计缺陷，造成此部位成为一个薄弱点。 2楼板设计常见问题 2.1设计时为了计算方便或因对板的受力状态认识不足，简单地将双向板作用按单向板进行计算。使计算假定与实际受力状态不符，导致一个方向配筋过大，而另一方向配筋不足，致使板出现裂缝。 2.2楼板承受线荷载时弯矩计算问题。在民用建筑中，常在楼板上布置一些非承重隔墙，故楼板设计中，通常将该部分的线荷载换算成等效的均布荷载后，进行楼板的配筋计算。有些设计人员图省事，错误地将隔墙的总荷载附以该板块的总面积。这样会造成非承重隔墙分布宽度内配筋量不足，而此板块其它部分配筋过大，这样隔墙处楼板会出现裂缝。 2.3双向板有效高度取值偏大。双向板在两个方向均产生弯矩，由此双向板跨中正弯矩钢筋是纵横叠放，短跨方向的跨中钢筋应放在下面，长跨方向的跨中钢筋置于短跨钢筋的上面，计算时应用两个方向的各自的有效高度。一般长向的有效高度比短向的有效高度小 d（d 为短向钢筋的直径）有的设计者为图省事或对板受力认识不足，而取两上方向的有效高度一致进行配筋计算，致使长跨有效高度偏大，配筋降低，致使结构构件存在的质量隐患，甚至出现开明缝的现象。 3楼层平面刚度的问题一些设计在缺乏基本的结构观念或结构布置、缺乏必要措施时，采用楼板变形的计算程序。结构设计存在着结构不安全或者某些部位或构件安全储备过大等现象。为了使程序的计算结果基本上能反映结构的真实受力状况，而不致于出现根本性的误差，设计时应尽可能将楼层设计成刚性楼面。要做到这一点，首先，应在建筑设计方案阶段就避免采用楼面有变形的平面，比如楼层大开洞、外伸翼块太长、块体之间成“缩颈”连接、凹槽缺口太深等。其次，要从结构布置和配筋构造上给予保证，对于使用功能确实必需的，或者建筑效果十分优越的建筑设计，如果其平面无法完全符合刚性楼板的假定，那么在结构设计时，可以通过增设连系梁板、洞口边加设暗梁边梁、提高连系梁板或暗梁边梁的配筋量、采用斜向配筋或双层配筋形式等方法，尽量满足刚性楼板的基本假设，或者弥补由于不是绝对的刚性楼板假定而产生的计算“误差”。 4砖混结构房屋中构造柱兼作承重柱用在砖混结构中，构造不但能够提高墙体的抗剪能力，而且构造柱与固梁联结在一起，形成对砌体的约束，这对于限制墙体裂缝的开展，维持竖向承载力，提高结构的抗震性能有着重要的作用在当前结构设计中，构造柱经常被作为承重柱使用，这种作法将引起以下几个问题。 4.1构造柱作为承重柱使用后，使得构造柱提前受力，这不但会降低构造柱对彻底的拉结和约束作和，而且结构一旦遭遇地震作用时，在构造柱位置必然形成应力集中，首先破坏这样构造柱不但起不到其应有的作用，反而成为房屋结构中的一个薄弱的部位。 4.2构造柱一般生根于地圈梁中，没有另设基础，构造柱兼作承重柱使用后，柱底基础的抗冲切、抗弯部及局部承压强度必然不能满足要求。柱底基础一旦发生冲切或局部承压被出现裂缝。本文建议承重大梁下的柱子应按承重柱设计。若梁上荷载和跨度都比较小时，构造柱也可布置于梁下，但此时必须按不考虑构造柱作用来验算下墙体的局部承压和抗弯强度。经验算满足，方可在粱下布置构造柱。 5承重柱截面高度设计过小这种情况多发生于六度抗震设防区。一些结构设计人员误认为六度设防就是不设防，为受力分析方便，他们故意把柱子的截面高度设计得过小，使梁柱的线刚度比加大。把梁简化为铰支梁，梁柱按轴心受压计算。这种做法虽然易于进行结构受力分析，但却给房屋结构埋下了隐患。因为，这样做忽略了梁柱间的刚结作用，加之柱截面的配筋都较小，结构一旦受力后，柱顶抗弯刚度必然不足，从而柱子在梁底附近将会出现一条或多条水平裂缝，形成塑性饺。这样在正常使用情况下，柱子已开始带铰工作。这不但影响了房屋的耐久性，而且也常常引起用户的恐惧心理。更为严重的是，这样的结构一旦遭遇地震作用，将会倒塌，这违背了现行抗震规范中“强柱弱梁”的设计原则。

引物设计注意事项

引物设计首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。非配对结构最好出现在引物中间。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

引物的应用常识

引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， ?引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 ?平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 ?3’-序列 3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。 ?避免互补的引物序列

景观设计面试常见问题

景观设计面试常见问题这是一篇由网络搜集整理的关于景观设计面试常见问题的文档，希望对你能有帮助。一、园林景观照明设计的一般步骤： (一) 分析相关资料； 1、了解该园林所处城市的人文、历史；考察其周边相类似园林的景观照明特色。 2、了解园林景观设计师对该园林景观的设计定位。 (二) 提出设计理念； 1、分析该园林的周边环境和景观特色，概括提炼出对景观照明设计有用的元素。 2、提出景观照明设计的理念。 (三) 进行照明分析； 1、游园路线分析，得出游人根据该游线观赏园林时的视觉焦点和该游线上各景观节点的主次关系。（简单介绍一下，功能照明的实施方案） 2、景观节点的功能分析，推论出园内各节点的设计风格以及实施景观照明时必须达到的亮度。 3、主要场景分析，根据游园路线分析和景观节点的功能分析，提炼出该园林中几个主要的视点，形成大的视觉场景。 (四) 深化照明设计深化设计过程中，各场景的景观照明设计必须紧扣总的设计理念，在以上

景观照明分析的指导下，按照景观节点的主次、景观照明的强弱、被观察的先后等关系进行设计。二、不同类型景观的设计表现： (一) 建筑物的夜景照明建筑物的夜景照明，最常用的有泛光照明、轮廓照明、内透光照明等。建筑立面的泛光照明就是用投光（泛光）灯按设计计算的一定角度直接照射建筑物立面，重塑建筑物的夜间的形象。其效果不仅能显现建筑物的全貌，而且能将建筑物的造型，立体感，饰石材料和材料质感，乃至装饰细部处理都能有效地表现出来。泛光照明不是简单地重现建筑物的白天形象，而是利用投光照明的光、色、影的手段，重塑建筑物在夜间更加动人、俏丽、雄伟壮观的形象。建筑轮廓照明就是用线光源（串灯、霓虹灯、美耐灯、导光管、LED光条、通体发光光纤等）直接勾画建筑轮廓。用窄光束光照射建筑物边缘也可起到勾勒轮廓的作用。泛光照明内透光照明轮廓照明内透光照明就是利用室内光或装置在特殊位置的灯具从建筑物内部向外透射光线，形成玲珑剔透的夜景照明效果。 (二) 广场的夜景照明广场的形状与面积既无定形又式样繁多，设置照明必须抓住满足功能照明为前提，根据广场的'固有特色，充分发挥广场的机能。