引物设计注意问题

1．3，端不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。

2．3，端的△G不宜过高，过高会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，其绝对值应该小一些，最好不要超过9。

3．发夹结构（Hairpin Formation）△G绝对值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。

4．上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。

5．Tm 值可以控制在50～70度之间。

6．错配（False priming）一般的原则要使错误引发效率在100以下。

7. 等级评定（rating）搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。

8. 内部稳定性（Internal stability）一般引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。△G绝对值越大结构越稳定。

9. 3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下。10. GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。

11. GC钳（GC Clamp）一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。而 3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于 3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。

12. 二聚体（Dimer）3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增。

13. 如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的（16～18 mer）的引物：若产物长5 kb，则用20～23 mer的引物。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。