天然药物化学第五章 黄酮类化合物--2
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3. 葡聚糖疑胶(Sephadex gel)柱层析： 对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶 ：Sephadex-G型及Sephadex LH-20型。
Sephadex G 适用于水系统 Sephadex LH-20 适用于水及有机溶剂系统
三、 黄酮类化合物的提取与分离
对得到的粗提物可进行下列精制处理，常用方法有： （一）溶剂萃取法 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不 同溶剂进行地萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶 子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡 萝卜素等脂溶性色素。而某些药料水溶液则可加入多 倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质 。
三、 黄酮类化合物的提取与分离
有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常 用的溶剂系统有：水-乙酸乙酯，正丁醇-石油醚等。 溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到 分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。 （二）碱提取酸沉淀法 黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸 性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再于碱水 提取液中加入酸，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便 易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取都应用了这个 方法。
三、 黄酮类化合物的提取与分离
（三）碳粉吸附法 主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗 提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性 检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸收炭末 ，依次用沸甲醇、沸水、7%酚/水、15%酚/醇溶液进行 洗脱，各部分洗脱液进行定性检查（或用PPC鉴定）。
三、 黄酮类化合物的提取与分离
OH
HO
O
OH
HO
O
OH
OH
O
OH
Rha-GlcO
OH
O
O
A
GlcO O OH
O
B
O
OH
O
OH
O
OH
D
C
Rha-GlcO O OH
OH
O
E
洗脱顺序： 洗脱顺序： 聚酰胺： 聚酰胺：D>E>C>B>A 硅胶： 硅胶：A>B>C>D>E
影响因素： 、 影响因素：a、溶质的影响
三、 黄酮类化合物的提取与分离
三、 黄酮类化合物的提取与分离
兹以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。 槐米（槐树Sophora japonica L. 花蕾）加约6倍 量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH8-9，在此 pH条件下微沸20-30分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍 水煎1次，趁热抽滤。合并滤液在60-70℃下，用浓盐酸 调至pH为5，搅匀，静置24小时，抽滤。沉淀物水洗至 中性，60℃干燥得芦丁粗品，于水中重结晶，70-80℃ 干燥得芦丁纯品。
三、用聚酰胺柱色谱分离下述化合物, 以不同浓度的甲醇进行 洗脱, 其出柱先后顺序为(C )→(A )→(D )→( B )
OH OH O CH3 O OHO O O HO O OH OH OH
A
O O glu O Rha
B
O O HO O O O OH OH
C
D
下列黄酮化合物 （1）用聚酰胺柱色谱，含水甲醇梯度洗 （2）用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，分别 写出洗脱顺序。
二、分离 现将较常用的方法介绍如下： 现将较常用的方法介绍如下： （一）柱层析法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚 酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及 硅藻土等。
1. 硅胶柱层析：此法应用范围最广，主要适于分离 异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（ 或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在 加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物， 如多羟基黄酮醇及其苷类等。 吸附规律：极性大吸附牢。 如：A 苷元 Rf :A>B>C B 单糖苷 C 二糖苷
三、 黄酮类化合物的提取与分离
2. 聚酰胺柱层析：其吸附强度主要取决于黄酮类化合 物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或 与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。 聚酰胺柱层析可用于分离各种类型的黄酮类化合物 ，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等黄酮类化合物 从聚酰胺柱上洗脱时大体有下列规律： （以下规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的 行为。 ）
第五章 黄酮类化合物 (flanonoids)
三、 黄酮类化合物的提取与分离 （一）提取
黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮等） ，一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇提取。一些多糖苷 类可用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入 少量酸（0.1%盐酸，应当慎用，避免发生水解）。 大多数黄酮苷元宜用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等中极 性溶剂提取，而对多甲氧基黄酮类游离苷元，甚至可 用苯等低极性溶剂进行提取。
（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是： 三糖苷>双糖苷>单糖苷>苷元 （2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减缓 （3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是： 异黄酮>二氢黄酮醇>黄酮>黄酮醇 （4）分子中芳香核、共轭双键多者则吸附力强，故 查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。
OH
O
O
O
OH
O
O
O
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O
三、 黄酮类化合物的提取与分离
在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液 浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热破坏黄酮 母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成（ 金羊）盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降 低产品收率。 当药料中含有大量果胶、粘液等不溶性杂质时，如 花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水 溶液进行提取，以使上述含羟基的杂质生成钙盐沉淀 ，不致溶出。这也有利于黄酮类化合物的纯化处理。
Sephadex G 适用于水系统 Sephadex LH-20 适用于水及有机溶剂系统
三、 黄酮类化合物的提取与分离
对得到的粗提物可进行下列精制处理，常用方法有： （一）溶剂萃取法 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不 同溶剂进行地萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶 子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡 萝卜素等脂溶性色素。而某些药料水溶液则可加入多 倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质 。
三、 黄酮类化合物的提取与分离
有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常 用的溶剂系统有：水-乙酸乙酯，正丁醇-石油醚等。 溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到 分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。 （二）碱提取酸沉淀法 黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸 性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再于碱水 提取液中加入酸，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便 易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取都应用了这个 方法。
三、 黄酮类化合物的提取与分离
（三）碳粉吸附法 主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗 提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性 检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸收炭末 ，依次用沸甲醇、沸水、7%酚/水、15%酚/醇溶液进行 洗脱，各部分洗脱液进行定性检查（或用PPC鉴定）。
三、 黄酮类化合物的提取与分离
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洗脱顺序： 洗脱顺序： 聚酰胺： 聚酰胺：D>E>C>B>A 硅胶： 硅胶：A>B>C>D>E
影响因素： 、 影响因素：a、溶质的影响
三、 黄酮类化合物的提取与分离
三、 黄酮类化合物的提取与分离
兹以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。 槐米（槐树Sophora japonica L. 花蕾）加约6倍 量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH8-9，在此 pH条件下微沸20-30分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍 水煎1次，趁热抽滤。合并滤液在60-70℃下，用浓盐酸 调至pH为5，搅匀，静置24小时，抽滤。沉淀物水洗至 中性，60℃干燥得芦丁粗品，于水中重结晶，70-80℃ 干燥得芦丁纯品。
三、用聚酰胺柱色谱分离下述化合物, 以不同浓度的甲醇进行 洗脱, 其出柱先后顺序为(C )→(A )→(D )→( B )
OH OH O CH3 O OHO O O HO O OH OH OH
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O O glu O Rha
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O O HO O O O OH OH
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下列黄酮化合物 （1）用聚酰胺柱色谱，含水甲醇梯度洗 （2）用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，分别 写出洗脱顺序。
二、分离 现将较常用的方法介绍如下： 现将较常用的方法介绍如下： （一）柱层析法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚 酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及 硅藻土等。
1. 硅胶柱层析：此法应用范围最广，主要适于分离 异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（ 或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在 加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物， 如多羟基黄酮醇及其苷类等。 吸附规律：极性大吸附牢。 如：A 苷元 Rf :A>B>C B 单糖苷 C 二糖苷
三、 黄酮类化合物的提取与分离
2. 聚酰胺柱层析：其吸附强度主要取决于黄酮类化合 物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或 与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。 聚酰胺柱层析可用于分离各种类型的黄酮类化合物 ，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等黄酮类化合物 从聚酰胺柱上洗脱时大体有下列规律： （以下规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的 行为。 ）
第五章 黄酮类化合物 (flanonoids)
三、 黄酮类化合物的提取与分离 （一）提取
黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮等） ，一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇提取。一些多糖苷 类可用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入 少量酸（0.1%盐酸，应当慎用，避免发生水解）。 大多数黄酮苷元宜用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等中极 性溶剂提取，而对多甲氧基黄酮类游离苷元，甚至可 用苯等低极性溶剂进行提取。
（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是： 三糖苷>双糖苷>单糖苷>苷元 （2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减缓 （3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是： 异黄酮>二氢黄酮醇>黄酮>黄酮醇 （4）分子中芳香核、共轭双键多者则吸附力强，故 查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。
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三、 黄酮类化合物的提取与分离
在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液 浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热破坏黄酮 母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成（ 金羊）盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降 低产品收率。 当药料中含有大量果胶、粘液等不溶性杂质时，如 花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水 溶液进行提取，以使上述含羟基的杂质生成钙盐沉淀 ，不致溶出。这也有利于黄酮类化合物的纯化处理。