单抗制备的详细步骤

病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污 染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如 SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653 和 NSO/1 都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系， 只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞 MOPC-21 等的不足。再 后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是 一样的。 （二） 基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者 所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设 备：超净工作台、CO2 恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或 电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、 真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml 细胞培养瓶，10ml、1ml 刻 度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml 盐水瓶， 青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml 注射器等，96 孔、24 孔细胞培养板，融合管（50ml 圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器 （~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200 目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交 瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关 部分。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单 抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图 6-1 概括了淋巴细胞杂交瘤 技术研制单抗的主要过程。 1、动物免疫
2-3 月 中等 强
B.10-50ug 其后 200-400ug 2 其后 4 每月
每天 中等 中等 C.10-100ug 2
其后 4 其后“休息” 最后加强
每月
10 天 1-2 月
中等
中等或强
(摘自刘秀梵) 体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如 引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免 疫法。因此，针对这些情况，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴 结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨 髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取 4-8 周龄 BALB/c 小鼠的脾脏，制成单细胞悬液， 用无血清培养液洗涤 2-3 次，然后悬浮于含 10%小牛血清的培养液中，再加入适量 抗原（可溶性抗原 0.5-5ug/ml，细胞抗原 105-106 个细胞/ml）和一定量的 BALB/c 小鼠胸腺细胞培养上清液；在 37℃，6%CO2 浓度下培养 3-5 天，再分离脾细胞与骨 髓瘤细胞融合。 2、细胞融合 （1） 主要试剂的配制 a、 细胞培养基 杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有 RPMI-1640 或 DMEM （Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定 的程序，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。 •不完全 RPMI-1640 培养基：RPMI-1640 培养基原液 96ml 100×L.G.溶液 1ml 双抗溶液 1ml 7.5% NaHCO3 溶液 1-2ml HEPES 溶液 1ml •不完全 DMEM 培养基：DMEM 13.37g 超纯水或四蒸水 980ml NaHCO3 3.7g
单克隆抗体研制最详细步骤
单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制 备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗 原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定 簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原 决定簇的常规血清抗体，仍是由不同 B 细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常 规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克 隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来 许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免 疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975 年，Kohler 和 Milstein 建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小 鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成 B 细胞杂交瘤。这 种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速 增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到 来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原 决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术 的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获
表 6-1 不同免疫抗原的免疫程序 免疫原特性 抗原量 接种次数 间隔时间 单抗的特性
抗体滴度 亲和性 免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等） 106-107 个细胞或 1-10ug 2-4
2-4 周 高
中等至强 免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4 周 中等或高 中等或强
免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 随后 2-3 每月
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得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler 和 Milstein 两人由此杰出贡献而荣获 1984 年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一） 杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果， 抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生 机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、 细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975 年 8 月 7 日，Kohler 和 Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养” （Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名 论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的 骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交 细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺 嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体 里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是 HGPRT+，但不能连续培养，只 能在培养基中存活几天，而未融合的 HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的 HGPRT-骨髓 瘤细胞不能在 HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得 到分别来自亲本脾细胞的 HGPRT 和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在 HAT 培 养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红 细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交 瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台
免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞 融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第 4 天和第 22 天，在初次免疫应答时获得的 杂交瘤主要分泌 IgM 抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌 IgG 抗体。笔者 体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清 抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在 最后一次加强免疫后第 3 天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高 小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫 3 天后即可融合。
(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的 抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越 纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限， 或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分 的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特 别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是 与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特 异性和敏感性。 (2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为， 所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓 瘤细胞都来源于 LOU/c 大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免 疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交 瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以 8-12 周龄为宜，雌性鼠较便于操作。 (3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使 B 淋巴 细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌 特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、 抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。 没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆 抗体的方法。表 6-1 列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下 注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用 腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在 最后一次加强免疫后第 3 天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次
双抗溶液 10ml 100×L.G.溶液 10ml 用 1N HCl 调试 PH 至 7.2-7.4，过滤除菌，分装 4℃保存。 •完全 RPMI-1640 或 DMEM 培养基：不完全 RPMI-1640 或 DMEM 培养基 80ml 小牛血清 15-20ml 用于骨髓瘤细胞 SP2/0 和建株后的杂交瘤细胞培养。 •HT 培养基：完全 RPMI-1640 或 DMEM 培养基 99ml HT 贮存液 1ml •HAT 培养基：完全 RPMI-1640 或 DMEM 培养基 98ml HT 贮存液 1ml A 贮存液 1ml b、 氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L） : 称取 1.76mg 氨基喋呤 （Aminopterin MW 440.4），溶于 90ml 超纯水或四蒸水中，滴加 1mol/L NaOH 0.5ml 中和，再补加超纯水或四蒸水至 100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。 c、 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 称 取 136.1mg 次 黄 嘌 呤 (Hypoxanthine,MW 136.1) 和 38.8mg 胸 腺 嘧 啶 核 苷 (Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至 100ml，置 45-50℃水浴中使完全溶解， 过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置 37℃加温助溶。 d、L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）: 称取 2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine， MW 146.15），用 100ml 不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装 小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。 e、 青、链霉素（双抗）溶液（100×）: 取青霉素 G（钠盐）100 万单位和链霉素 （硫酸盐）1g，溶于 100ml 灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻