实验三 柠檬酸发酵

实验二柠檬酸发酵
【课前预习】
复习微生物学及实验过程、发酵工程、生物分离工程所学到的微生物培养及生物物质分离的分离方法，了解影响微生物生长及生物物质提取过程中的各种影响因素。

【实验目的】
1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。

2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；
3. 通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验
得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。

【实验要求】
1. 10-15 人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。

2. 总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。

【实验原理】
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。

黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。

其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2C6H8O7+2H2O
【实验用品】
1. 实验主要仪器设备
摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；析天平；蒸发器；分光光度计；比色管；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡萄糖；草酸铵结晶紫
液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。

取A液20mL，B 液80mL 混合，静置48 小时后使用)
2. 材料
菌种：黑曲霉（本实验室保存）
培养基：
黑曲霉种子培养基：20%玉米粉糖化液。

发酵培养基：20%玉米粉糖化全液与过滤后的玉米糖化清液1：5混合。

【方法步骤】
1. 摇瓶种子制备
1.1 摇瓶发酵培养基的配置
将玉米粉用100目筛子筛好备用，称取200g玉米粉于烧杯中，同时加入自来水800ml，即质量比自来水：玉米粉为4:1，混匀。

1.2 培养基的糖化
边加热边搅拌培养基，待加热到90℃后，加入高温淀粉水解酶0.5-1ml，加热搅拌恒温保持20～30min，防止糊化粘壁，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全。

得到20%玉米水解液全液（含碳6.73%，氮1.26%）。

注：筛玉米粉的目的是便于下次接种时菌种能以液体形式轻松吸出，用碘液检验淀粉含量时要待被检测液冷却后才能检测，否则结果不准确。

装入摇瓶的培养基不能太多，否则培养过程中黑曲霉所需要的氧气则不充分。

1.3分装、灭菌
将糖化好的培养基装入2个摇瓶（锥形瓶）中，装入量为摇瓶总体积的1/10, 2-4层纱布封口，121.3℃，灭菌15-20min。

1.4 接种
待糖化好的培养基温度降至40℃以下时，将活化的黑曲霉孢子（约为4-5片麸皮）接种入培养基中，在33-36℃，200-300r/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。

注：进行下一步操作前应用显微镜检测菌球的生长状况，若菌丝细长则说明黑曲霉已经提前进入柠檬酸发酵时期，会导致后期的柠檬酸产量降低。

2. 发酵培养
2.1 发酵培养基的配置
将配置摇瓶发酵培养基时所剩的约700ml糖化培养基取出100ml，另外600ml用滤布（2-4层纱布）过滤，得到透明清液（含碳7.27%，氮0.13%），然后将未过滤的糖化培养基与500ml过滤后的清液混匀。

2.2 分装、灭菌
取40ml混合后的培养基加入500ml摇瓶（小于总体积的1/10），2层纱布封口，121.3℃，灭菌15-20min。

2.3 接种
待培养基温度降至40℃以下，接入发酵种子2ml，24h前于转速100r/min，24h后于转速200-300r/min摇床上，35℃连续培养72h。

注：发酵过程中不能断氧，否则发酵失败。

2.4 发酵过程检测
2.4.1 还原糖、柠檬酸的检测
发酵0、24、48、72h分别各取下两瓶检测还原糖（残糖）、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸的生成速率；
2.4.2 pH 值的检测
每隔12 小时检查pH 值。

2.4.3 黑曲霉菌丝形态的观察
每隔12 小时镜检黑曲霉菌丝的形态变化。

【检测方法】
1、黑曲霉镜检
方法一：直接取一滴发酵液于载玻片上，用盖玻片密封后镜检。

方法二：镜检过程：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检（染料：草酸铵结晶紫液）。

2、pH 的跟踪测定：pH 计。

3、还原糖（残糖）的测定
方法一：DNS 还原糖测定法。

方法二：发酵完成后取发酵清液2ml稀释到500ml，取1ml加菲林A、B各5ml，加热到沸腾，用葡萄糖溶液滴定残糖。

4、柠檬酸的测定
见下一实验教案
【实验结果】
1、不同时间点菌丝形态和pH的变化
2、还原糖（残糖）与柠檬酸含量的测定
计算公式=标准曲线上查得的还原糖克数×（提取液总体积/测定时提取液体积）
计算公式酸度=消耗0.1429mol/L的NaOH 的毫升数
【思考题】
从黑曲霉活化至最后进入摇瓶发酵，中间可否省略发酵种子扩大培养这一步？为什么？【实验报告】
1. 姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间。

2. 实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。