蛋白质印迹法westernblot应用介绍32页PPT

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western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件

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膜的选择
1. PVDF膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔 径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜,小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体; 2.发光试剂; 3.反应的杂质;
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洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时,strip二抗即可
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三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
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Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄;
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间, 进行动态连续拍摄,拍 摄得高质量的图片;
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准
确性! .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇,DTT)可以断开二 硫键,破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。

电转仪长期使用导致海绵变薄,

“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低,电流或电
压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉

蛋白质印迹法westernblot应用介绍

蛋白质印迹法westernblot应用介绍
高通量Western Blot技术的应用范围广泛,包 括药物筛选、疾病诊断和治疗、蛋白质功能研 究等领域。
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平,为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法,通过与标准品进行比较,计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛,包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用,如质 谱技术、免疫共沉淀等,以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用,可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息,有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot,可以验证抗体的 特异性,确保抗体只针对目标蛋白进 行反应,而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot,可以测试抗体的最 佳稀释度,以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛,包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合,可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息,为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。

westernblot详解PPT课件

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蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小; 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况,并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
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上样缓冲液 Loading buffer
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一 配分离胶
准备物品: 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯( 1 ml 200ul 20ul) 30%Acrylamide 1M (4度冰箱), Tris-HCL 溶液( PH=8.8), ddH2O 10%AP (-20冰箱) , TEMD(4度 ) ,SDS(常温) 1 清洗玻璃板: 一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶: 玻璃板对齐后放入夹中加紧,注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下:
1.将200mg组织块剪碎,置于1ml裂解液中(
5ml离心管)。
2.匀浆器进行匀浆,注意冰上操作,匀浆后置于
冰上。
3.10,000g ,4℃,10min,(5ml管)离心
4.取上清至1.5ml管,12,000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
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3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板,将其放入电 泳槽中。注意,小玻璃板面向内,大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is(掉M梳W子1,2注1.1意4动)作轻柔。

《westernblot讲解》PPT课件

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K和ɑ为常熟,de为蛋白质移动距离,do为小 分子示踪物的移动距离。
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TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基,从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项: 易燃,有腐蚀性,请注意防护。 易挥发,使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
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精选课件ppt 25
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精选课件ppt 20
图像分析
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将胶片扫描或拍照,用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
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注释
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SDS为十二烷基硫酸钠,它是一种阴离子表面 活性剂,与蛋白质结合成复合物,使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷,从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂,能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
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仪器:电转移装置(实验室为Bio-Rad公司装 置) 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
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样品制备
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样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
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试剂及仪器准备

蛋白质印迹法westernblot应用介绍幻灯片PPT

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(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后,把蛋白样品直接上样到
SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶,70V 35Ma/块 45 min;跑下层胶,100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 -|纸|胶|膜|纸|+
凝胶浓度(%) 6 8 10 12 15
最佳分离范围(KD) 50-150 30-90 20-80 12-60 10-40
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶〔别离胶〕
静置1h后制上层胶〔浓缩胶〕 2、配制上层胶〔浓缩胶〕
加完后插上梳子,静置1h
制胶
制胶过程本卷须知:
➢操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。 ➢加完别离胶后胶,加水液封时要很慢,否那么胶会 被冲变型。 ➢灌胶时开场可快一些,胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不 会有气泡。 ➢别离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 ➢插梳子时要使梳子保持水平。
Western Blot流 程
收集蛋白样品
(Protein sample preparation)
〔1〕贴壁细胞蛋白样品收集
分屡次将细 胞收至一个 管中
A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。
B 参加PBS冲洗2-3遍,再将PBS转移至离心管中,离心
收集细胞。
C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上,然后将离心好的离心
Western Blot 介 绍
蛋白质印迹的创造者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯 塔克〔George Stark〕。在尼尔·伯奈特〔Neal Burnette〕于 1981年所著的?分析生物化学?〔Analytical Biochemistry〕中首 次被称为Western Blot。

Western-blot实验方法步骤PPT教学课件

Western-blot实验方法步骤PPT教学课件
• 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 • 4度,13000rpm,30分钟离心。分成三层:上
层为油脂,中层为蛋白质,下层为沉淀。 • 有必要时重复上一步骤。 • 上清用于做SDS-PAGE,如不能立即做,可将上
清转入另一Eppendorf -80°C保存
注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率,时间,次数。插得深不起泡
沫。 • 检测蛋白的敏感性1-5ng,0.75mm厚的
SDS-PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋 白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
主要试剂
• RIPA(华舜公司) • 苯甲基磺酰氟PMSF(华舜公司) • 丙烯酰胺(Amresco公司) • 双丙烯酰胺(Amresco公司) • 丽春红染料(华舜公司) • Tween 20(Amresco公司) • 过硫酸铵(Sigma公司) • 四甲基乙二胺TEMED(Sigma公司) • 硝酸纤维素膜(Amersham公司) • 考马斯亮兰(Fluka公司) • 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体(Santa Cruz公司) • Phototope-HRP Western Blot Detection System(Cell Signaling
• 被广泛地用于蛋白质研究,基础医学和临床医学 的研究。
溶解蛋白策略
• 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来,但这 可能导致免疫反应性的丢失。
• 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态,但这造 成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。
• 机械破碎细胞,可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞 表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力, 变性蛋白比天然蛋白更容易降解。

优化蛋白质免疫印迹Western Blot精品PPT课件

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Western Blot
2.转移膜的选择
(1)最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素 (Nitrocellulose,NC)膜和聚偏二氟乙烯 (Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜,此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜 做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。
③拖尾
样品溶解不好
④纹理(纵向条纹)样品中含有不溶性颗粒。
⑤条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜。
⑥条带两边扩散 加样量过多
需要注意:
Western Blot
(1)凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀, 动作轻缓,放置加样孔出现不平。
(2)拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把 上样带扭曲。
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度(%) 15 10 7.5 5.0
线性分离范围(KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
Western Blot
(2)避免电泳中出现以下情况
①条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却,中间冷却不好或电泳系统温
度偏高。
②条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适,特别是 凝胶和玻璃
Western Blot
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
Western Blot
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Western Blot(间接)一般流程:
三种膜的比较
Western Blot

western blot原理及操作方法ppt课件

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常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源,如:一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体,则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体, 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散:加样量过多 10.条带两边高,中间凹 原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状,中间高,两边低 原因:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡,或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因:样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快,容易产生气泡影响聚合,导致 电泳带畸形。 太慢不均匀,特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后,立即覆一层双蒸水,一是为了使分离胶界 面保持水平,用水就可以把它压平,使蛋白质分子跑时在 同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜保湿,避 免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路 6.电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时,一定要戴手套,因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点,防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗:羊抗兔IgG/HRP(辣根过氧化酶) 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer(贮存液) 4℃保存 • 10×转印Buffer(贮存液)的配制: • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer(工作液): • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL

蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件

蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸,在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面,使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡,将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿,用蒸馏水淋洗石墨电极,先将三层浸湿的滤纸放在阳极上,在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡,再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上,用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上,用玻璃棒小心去除气泡,再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上,沁心去除气泡,最后加上石墨电极板,接通电源 进行电转移,电流的大小由凝胶的大小决定,为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后,停止通电,卸掉电转移装置,取下凝胶进行考马斯亮兰 染色,以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜,放在一张干 滤纸上,吸干30-60分钟后,开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
(Western Blotting)
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1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离, 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上,这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体(称为第 一抗体)为探针,与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应,最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体(第二抗体)与第一抗体进行免疫反应, 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应,结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白,通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时,同时1:100加入兔抗GST

Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件

Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
子时要使梳子保持水平。)
④ 用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。若只跑一块胶,
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)
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清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后,计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4:15*Loading Buffer于离心管,100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min,离心15min,13000rpm,4℃。
2.结果分析
3.注意事项

实验室常见问题解答
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蛋白样品制 备 蛋白含量测

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在六孔板中,按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液,用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min(中间混 匀5-6次)直至 裂解完全。
充分裂解后,1000014000g离心3-5分钟, 取上清,即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气
泡也可能使样品溢出。)
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清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟,可多跑几分钟; 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例:诸延慧,容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
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检测样品中特异性蛋白质是否
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Western Blot介绍 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western Blot 介绍
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯 塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年 所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称 为Western Blot。
目前常用比色法测定样品蛋白的含量:Bradford法(考马 斯亮蓝法)、Lowry法(福林-酚试剂法)、 BCA法等。
1、配制BSA标准溶液:0、25、50、100、150、200、 300 μg/mL(用PBS配制)。
样品液:取原液2 μL至200 μL (用PBS配制)。 2、操作:先取一块新的96孔板,于630nm下测光密度值 ,取溶液/样品40μL和E液40μL,每个浓度点均作三复孔,振 荡混匀。37°C反应10 min后,加入福林酚试剂(1:15稀释) 160μL,振荡混匀,37°C反应30 min。630 nm下测光密度 值。以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线,计算待测样 品蛋白浓度。

转膜后检测(此步可以省略)
✓ 丽春红染色 蛋白带出现后,于室温用去离子水漂洗硝酸
纤维素滤膜,换水几次。
✓ 印度墨汁染色 只。
封闭(Blocking)
将转印膜浸泡到封闭液中,将膜上没有结合蛋白 质的区域结合上蛋白质,目的是使抗体与特异的蛋白 质结合。 ➢ 封闭液 5 % TBST脱脂奶粉溶液(30ml) 牛血清白蛋白溶液( BSA ) ➢ 摇床上缓慢摇动封闭,室温2 h或4℃过夜。
影响抗原抗体反应的因素
电解质---电解质可促进抗原抗体复合物的形成,因 此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。
回收一抗。加入TBST液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤510分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗 涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤 次数。 注:Western结果通常需要提供内参作为对照,通常可以选 用Tubulin抗体或Actin抗体,进行内参检测。
二抗孵育 (Secondary antibody inucubation)
(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后,把蛋白样品直接上样到
SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶,70V 35Ma/块 45 min;跑下层胶,100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 -|纸|胶|膜|纸|+
槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸泡在转移装置的缓冲液中。 - |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|+
转膜条件: 推荐:100V ,1—2小时;根据蛋白大小以及胶厚度 的不同而不同。
转膜注意事项
➢ 滤纸、胶、膜之间不能有气泡。 ➢ 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。 ➢ 胶和膜上要做好标记,识别正反面和上下 。 ➢ PVDF膜需要100%甲醇预处理,后续操作中膜必须保持湿润
Tween-20的作用:减少非特异性吸附,不影响抗
体与抗原的结合。
一抗孵育 (Primary antibody incubation)
把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,加入稀释好的一 抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗 孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗 体的说明选择适当的孵育温度和时间。
蛋白检测 (Detection of proteins)
DAB显色 法
化学发光显色法(ECL )
ECL显色原理:(二抗用HRP 标记)反应物为过氧化物+鲁米诺, 如果遇到HRP即发光,可使胶片 曝光显影。
ECL化学发光显色
比较常用,结果容易控制,但是被催化是 灵敏度差一点
DAB显色
比较灵敏,是HRP最敏感的底物
(Protein sample preparation)
(1)贴壁细胞蛋白样品收集
分多次将细 胞收至一个 管中
A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。
B 加入PBS冲洗2-3遍,再将PBS转移至离心管中,离心收
集细胞。
C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上,然后将离心好的离心
管中的液体小心倾尽并放置于冰中,加入含PMSF的RIPA裂
蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织 总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特 异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现己广泛应用 于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等 多个方面。
Western Blot流程
收集蛋白样品
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离胶浓度与蛋白分离范围
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶(分离胶)
静置1h后制上层胶(浓缩胶) 2、配制上层胶(浓缩胶)
加完后插上梳子,静置1h
制胶
制胶过程注意事项:
➢操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。 ➢加完分离胶后胶,加水液封时要很慢,否则胶会被 冲变型。 ➢灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不 会有气泡。 ➢分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 ➢插梳子时要使梳子保持水平。
解液200μl于离心管中并移至对应的培养瓶中,摇晃培养瓶
使裂解液与贴壁的细胞充分接触,冰上裂解30min。
D 裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至1.5 ml
EP管中,再用超声破碎仪破碎细胞后,4℃下12000rpm离
心15min,吸取上层液体于新的离心管中,弃掉沉淀。
(2).蛋白含量测定(福林-酚法 )
NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,加入稀释好的荧 光二抗, 37 ℃缓慢摇动孵育一小时。二抗需根据一抗进 行选择,例如,一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需选择抗 小鼠IgG的二抗。
回收二抗。加入TBST液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟 。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间 并增加洗涤次数。
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