AZD8055抑制胆管癌细胞HuCCT1的迁移及EMT进程的机制研究
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｏｃｔ；３５（１０）：１４２９～３６
·１４２９·
网络出版时间：２０１９－９－５９：３３ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０１９０９０４．０９４０．０３６．ｈｔｍｌ
收稿日期：２ຫໍສະໝຸດ Baidu１９－０５－１５，修回日期：２０１９－０６－２１ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ３１４６０３０３，８１６６０６０９）；吉
林省科技厅自然科学基金项目（Ｎｏ２０１８０１０１００７）；吉林省 教育厅自然科学基金项目（ＮｏＪＪＫＨ２０１９１１１６ＫＪ） 作者简介：王 雪 （１９９１－），女，硕士 生，研究 方向：肿瘤分 子病理 学，Ｅｍａｉｌ：８２５８１１３４９＠ｑｑ．ｃｏｍ； 任香善（１９７６－），女，博 士，副 教 授，硕 士 生 导 师，研 究 方 向：肿 瘤 分 子 病 理 学，通 讯 作 者，Ｔｅｌ：０４３３２４３５０９２，Ｅ ｍａｉｌ：ｒｅｎｘｓｈ＠ｙｂｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＡＺＤ８０５５抑制胆管癌细胞
ＨｕＣＣＴ１的迁移及 ＥＭＴ进程的机制研究
王 雪１，３，毕宇宁１，３，闫文帝１，３，张 鑫１，３，董 颖１，３，匡子藤１，３，林贞花１，２，３，任香善１，２，３
（延边大学 １．肿瘤研究中心、２．医学院病理学教研室、３．吉林省科技厅重点实验室，吉林 延吉 １３３００２）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１９．１０．０１８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１９）１０－１４２９－０８ 中国图书分类号：Ｒ３２９．２４；Ｒ３９４．２；Ｒ７３５．８；Ｒ９１６４；Ｒ９７７６ 摘要：目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）双重抑 制剂 ＡＺＤ８０５５在抑制人胆管癌细胞 ＨｕＣＣＴ１的迁移及 ＥＭＴ 进程中的作用及分子机制。方法 ＭＴＴ法与平板克隆形成 实验检测 ＡＺＤ８０５５对胆管癌细胞增殖的影响；划痕愈合实 验和 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室迁移实验检测 ＡＺＤ８０５５对 ＨｕＣＣＴ１细胞 迁移能力的影响；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测 ＥＭＴ标志相关蛋白、 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路蛋白及 ＤＥＫ蛋白的表达；利用 ＳＴＩＴＣＨ、 ＧｅｎｅＭＡＮＩＡ数据库，分析 ＡＺＤ８０５５、ＤＥＫ、Ａｋｔ信号通路相互 作用关系；在 ＤＥＫ基因沉默后，检测胆管癌细胞增殖活力、 迁移能力及 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白表达水平的变化。 结果 ＡＺＤ８０５５可抑制胆管癌细胞的增殖及迁移能力，同时 抑制 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白、ＤＥＫ蛋白表达及 ＥＭＴ 的进程；沉默 ＤＥＫ基因可明显抑制胆管癌细胞增殖及迁移 能力，并降 低 Ａｋｔ、Ｓ６、４ＥＢＰ１蛋 白 的 磷 酸 化 水 平。结 论 ＡＺＤ８０５５抑制 ＨｕＣＣＴ１细胞的迁移及 ＥＭＴ进程，其机制与 下调 ＤＥＫ，抑制 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路有关。
“生物导弹”。 研究表明［３］，在胆管癌中，Ａｋｔ／哺乳动物雷帕霉 素靶蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）信 号通路异常激活，并与肿瘤的侵袭和转移等恶性进 程呈正相关。ｍＴＯＲ在体内以 ｍＴＯＲＣ１和 ｍＴＯＲＣ２ 两种复合物的方式存在［４］。研究发现，ｍＴＯＲＣ１的 特异性靶向药物雷帕霉素，易出现负反馈作用，导致 Ａｋｔ的磷酸化［５］。ＡＺＤ８０５５是一种新型的 ｍＴＯＲＣ１ 和 ｍＴＯＲＣ２双重抑制剂（结构见 Ｆｉｇ１Ａ），能有效抑 制 ｍＴＯＲＣ１复合物引起的 Ａｋｔ负反馈活性。在肝 癌、神 经 母 细 胞 瘤 等 多 种 肿 瘤 中，ＡＺＤ８０５５通 过 抑 制细胞增殖和 ／或诱导细胞凋亡，从而达到抗肿瘤作 用 ［６－８］，但在胆管 癌 中 的 抗 肿 瘤 作 用 及 其 分 子 机 制 尚未见报道。
关键词：ＡＺＤ８０５５；胆管癌；ＤＥＫ；上皮 －间质转化；增殖；迁 移；Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路
胆管癌是源自胆管上皮细胞的恶性肿瘤，具有 易发生转 移、预 后 差 等 特 点［１］。 目 前，其 治 疗 手 段 以外科手术 切 除 为 主，辅 以 放 化 疗［２］，但 常 规 放 化 疗方法具有毒副作用大、易耐药等缺点。近年来，分 子靶向治疗是一种快速发展的治疗方法，可特异性 的结合肿瘤细胞并诱导其凋亡，但不会伤及肿瘤周 围的正常组 织 细 胞，因 此，分 子 靶 向 治 疗 也 被 称 为
原癌基因 ＤＥＫ是一种染色质调节蛋白，在胆管 癌中 呈 高 表 达［９］，可 通 过 调 节 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信 号 通 路、转录因子等多种途径，促进肿瘤细胞生长、浸润 等过程［１０－１１］，提示 ＤＥＫ可作为抗肿瘤的靶点。因 此，本研究旨在探讨 ＡＺＤ８０５５对胆管癌细胞 ＨｕＣ ＣＴ１的抑制作用，阐明其分子机制，为胆管癌的临床 治疗提供新的实验依据及理论基础。 １ 材料 １．１ 细胞株 人胆管癌 ＨｕＣＣＴ１细胞，购自美国模 式培养物 保 藏 所 （ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＡＴＣＣ）细胞库。 １．２ 试剂 ＡＺＤ８０５５，购自美国 ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍｉｃａｌｓ 公司（批号：Ｓ１５５５），用 ＤＭＳＯ配制成 １ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 的浓缩液，分装保存于 －２０℃冰箱；胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、ＯｐｔｉＭＥＭ 培养基，均购自美国 Ｇｉｂｃｏ公司；ＲＰＭＩ１６４０培养基，购自美国 Ｃｏｒｎｉｎｇ公 司；ｐ４ＥＢＰ１、４ＥＢＰ１、ｐＳ６、Ｓ６、ｐＡｋｔ、Ａｋｔ、上皮型钙 黏蛋白（ＥＣａｄｈｅｒｉｎ）、波 形 蛋 白 （Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、转 录 因 子 Ｓｎａｉｌ抗体，均购自美国 ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 公司；ＤＥＫ抗体，购自美国 ＢＤ公司；βａｃｔｉｎ抗体， 购自美国 Ａｂｃａｍ公司；ＭＴＴ、二甲基亚砜 （Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ），均 购 自 美 国 Ａｍｒｅｓｃｏ；吉 姆 萨 （Ｇｉｍｅｓａ）染色液，购自日本 Ｗａｋｏ；ＤＥＫ小干扰 ＲＮＡ
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网络出版时间：２０１９－９－５９：３３ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０１９０９０４．０９４０．０３６．ｈｔｍｌ
收稿日期：２ຫໍສະໝຸດ Baidu１９－０５－１５，修回日期：２０１９－０６－２１ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ３１４６０３０３，８１６６０６０９）；吉
林省科技厅自然科学基金项目（Ｎｏ２０１８０１０１００７）；吉林省 教育厅自然科学基金项目（ＮｏＪＪＫＨ２０１９１１１６ＫＪ） 作者简介：王 雪 （１９９１－），女，硕士 生，研究 方向：肿瘤分 子病理 学，Ｅｍａｉｌ：８２５８１１３４９＠ｑｑ．ｃｏｍ； 任香善（１９７６－），女，博 士，副 教 授，硕 士 生 导 师，研 究 方 向：肿 瘤 分 子 病 理 学，通 讯 作 者，Ｔｅｌ：０４３３２４３５０９２，Ｅ ｍａｉｌ：ｒｅｎｘｓｈ＠ｙｂｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＡＺＤ８０５５抑制胆管癌细胞
ＨｕＣＣＴ１的迁移及 ＥＭＴ进程的机制研究
王 雪１，３，毕宇宁１，３，闫文帝１，３，张 鑫１，３，董 颖１，３，匡子藤１，３，林贞花１，２，３，任香善１，２，３
（延边大学 １．肿瘤研究中心、２．医学院病理学教研室、３．吉林省科技厅重点实验室，吉林 延吉 １３３００２）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１９．１０．０１８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１９）１０－１４２９－０８ 中国图书分类号：Ｒ３２９．２４；Ｒ３９４．２；Ｒ７３５．８；Ｒ９１６４；Ｒ９７７６ 摘要：目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）双重抑 制剂 ＡＺＤ８０５５在抑制人胆管癌细胞 ＨｕＣＣＴ１的迁移及 ＥＭＴ 进程中的作用及分子机制。方法 ＭＴＴ法与平板克隆形成 实验检测 ＡＺＤ８０５５对胆管癌细胞增殖的影响；划痕愈合实 验和 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室迁移实验检测 ＡＺＤ８０５５对 ＨｕＣＣＴ１细胞 迁移能力的影响；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测 ＥＭＴ标志相关蛋白、 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路蛋白及 ＤＥＫ蛋白的表达；利用 ＳＴＩＴＣＨ、 ＧｅｎｅＭＡＮＩＡ数据库，分析 ＡＺＤ８０５５、ＤＥＫ、Ａｋｔ信号通路相互 作用关系；在 ＤＥＫ基因沉默后，检测胆管癌细胞增殖活力、 迁移能力及 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白表达水平的变化。 结果 ＡＺＤ８０５５可抑制胆管癌细胞的增殖及迁移能力，同时 抑制 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路相关蛋白、ＤＥＫ蛋白表达及 ＥＭＴ 的进程；沉默 ＤＥＫ基因可明显抑制胆管癌细胞增殖及迁移 能力，并降 低 Ａｋｔ、Ｓ６、４ＥＢＰ１蛋 白 的 磷 酸 化 水 平。结 论 ＡＺＤ８０５５抑制 ＨｕＣＣＴ１细胞的迁移及 ＥＭＴ进程，其机制与 下调 ＤＥＫ，抑制 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路有关。
“生物导弹”。 研究表明［３］，在胆管癌中，Ａｋｔ／哺乳动物雷帕霉 素靶蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）信 号通路异常激活，并与肿瘤的侵袭和转移等恶性进 程呈正相关。ｍＴＯＲ在体内以 ｍＴＯＲＣ１和 ｍＴＯＲＣ２ 两种复合物的方式存在［４］。研究发现，ｍＴＯＲＣ１的 特异性靶向药物雷帕霉素，易出现负反馈作用，导致 Ａｋｔ的磷酸化［５］。ＡＺＤ８０５５是一种新型的 ｍＴＯＲＣ１ 和 ｍＴＯＲＣ２双重抑制剂（结构见 Ｆｉｇ１Ａ），能有效抑 制 ｍＴＯＲＣ１复合物引起的 Ａｋｔ负反馈活性。在肝 癌、神 经 母 细 胞 瘤 等 多 种 肿 瘤 中，ＡＺＤ８０５５通 过 抑 制细胞增殖和 ／或诱导细胞凋亡，从而达到抗肿瘤作 用 ［６－８］，但在胆管 癌 中 的 抗 肿 瘤 作 用 及 其 分 子 机 制 尚未见报道。
关键词：ＡＺＤ８０５５；胆管癌；ＤＥＫ；上皮 －间质转化；增殖；迁 移；Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路
胆管癌是源自胆管上皮细胞的恶性肿瘤，具有 易发生转 移、预 后 差 等 特 点［１］。 目 前，其 治 疗 手 段 以外科手术 切 除 为 主，辅 以 放 化 疗［２］，但 常 规 放 化 疗方法具有毒副作用大、易耐药等缺点。近年来，分 子靶向治疗是一种快速发展的治疗方法，可特异性 的结合肿瘤细胞并诱导其凋亡，但不会伤及肿瘤周 围的正常组 织 细 胞，因 此，分 子 靶 向 治 疗 也 被 称 为
原癌基因 ＤＥＫ是一种染色质调节蛋白，在胆管 癌中 呈 高 表 达［９］，可 通 过 调 节 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信 号 通 路、转录因子等多种途径，促进肿瘤细胞生长、浸润 等过程［１０－１１］，提示 ＤＥＫ可作为抗肿瘤的靶点。因 此，本研究旨在探讨 ＡＺＤ８０５５对胆管癌细胞 ＨｕＣ ＣＴ１的抑制作用，阐明其分子机制，为胆管癌的临床 治疗提供新的实验依据及理论基础。 １ 材料 １．１ 细胞株 人胆管癌 ＨｕＣＣＴ１细胞，购自美国模 式培养物 保 藏 所 （ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＡＴＣＣ）细胞库。 １．２ 试剂 ＡＺＤ８０５５，购自美国 ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍｉｃａｌｓ 公司（批号：Ｓ１５５５），用 ＤＭＳＯ配制成 １ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 的浓缩液，分装保存于 －２０℃冰箱；胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、ＯｐｔｉＭＥＭ 培养基，均购自美国 Ｇｉｂｃｏ公司；ＲＰＭＩ１６４０培养基，购自美国 Ｃｏｒｎｉｎｇ公 司；ｐ４ＥＢＰ１、４ＥＢＰ１、ｐＳ６、Ｓ６、ｐＡｋｔ、Ａｋｔ、上皮型钙 黏蛋白（ＥＣａｄｈｅｒｉｎ）、波 形 蛋 白 （Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、转 录 因 子 Ｓｎａｉｌ抗体，均购自美国 ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 公司；ＤＥＫ抗体，购自美国 ＢＤ公司；βａｃｔｉｎ抗体， 购自美国 Ａｂｃａｍ公司；ＭＴＴ、二甲基亚砜 （Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ），均 购 自 美 国 Ａｍｒｅｓｃｏ；吉 姆 萨 （Ｇｉｍｅｓａ）染色液，购自日本 Ｗａｋｏ；ＤＥＫ小干扰 ＲＮＡ