微生物细胞破碎
实验室常用的细胞破碎方法
实验室常用的细胞破碎方法
实验室常用的细胞破碎方法有物理法和化学法。
1、物理法
（1）反复冻融：将细胞反复放置于-20℃冷冻以及25-30℃环境下，反复冷冻溶解10次-20次。
适用于例如血细胞等大部分哺乳动物细胞。
（2）煮沸法：与冻融法相反，将细胞放置于100℃沸水煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
（3）超声法：将细胞放置于超声破碎仪中，以一定频率的超声破碎细胞，适用于绝大部分微生物细胞。
（4）渗透压法：将血细胞等细胞膜较为薄弱的细胞放置于纯水等低渗溶液，细胞吸收大量水分破解。
（5）液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨的方法破解细胞。
2、化学法
（1）强酸、强碱溶液：一般应用0.5N NaOH溶液可以裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。
（2）生物酶：一般用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。
微生物细胞的破碎
❖ KOLER gmbh
❖ 德国著名特制合金材料公司
ATS的技术合作伙伴－意大利FBF
ATS的合作伙伴FBF
❖ 成立于1987年，位于意 大利帕尔马
❖ 2002年来，每年生产近 300台高压均质机
❖ 设备销往全世界50多个 国家，有超过2000台设 备在各地运行。
ATS的合作伙伴FBF
可达较高破碎率，可大规模操作，对于少 量物料<100ml,难操作
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
微生物 壁厚/nm 层次
主要组 成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 酵母菌
20-80
10-13
100-300
单层
多层
多层
肽聚糖
肽聚糖
葡聚糖
（40-90%） （5-10%） （30-40%）
多糖
脂蛋白
❖ 2002年开发了新的 TITAN系列大型高压均 质机，成为欧洲发展最 迅速的高压均质机制造 商。
高压细胞破碎机工作原理
❖ 电机驱动 ❖ 柱塞泵加压 ❖ 均质点破碎
❖ 空穴效应 ❖ 剪切效应 ❖ 撞击效应
破碎发生点
高压破碎的要点
生化工艺——第二章细胞破碎
²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下， 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 被破碎。 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广； 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多 在实验室使用。 在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法 超声波法 细胞被研磨物 磨碎 用超声波的空 穴作用使细胞 破碎 适中 适中 适中 便宜 适中 昂贵 细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔， 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠 磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细 菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用， 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 使细胞破碎。 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
第三章 细胞破碎解读
有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
变性剂
盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲素（Urea） 是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而 使疏水性化合物溶于水溶液。
化学渗透法优点：
（5）化学渗透法 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地 渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结 构与组成。
表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双 分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。
原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞 环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力作用下破碎。
压力：50~70MPa 速度：450m/s
高压匀浆器针型阀结构简图
高压匀浆器各种阀型设计
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难 破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环 的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程， 被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方 程可表示为：
EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结
构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维
持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将 脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂 来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
细胞破碎实验报告结论
一、实验目的总结本次实验的主要目的是研究不同细胞破碎方法对微生物细胞破碎效果的影响，探讨不同破碎方法在微生物细胞提取中的应用前景。
通过对实验结果的观察和分析，旨在为微生物细胞破碎实验提供科学依据，为后续研究提供参考。
二、实验结果分析1. 实验材料及方法实验选用了一种常见的微生物细胞，采用化学破碎、机械破碎、超声波破碎和酶解破碎四种方法进行细胞破碎。
在实验过程中，分别记录了不同破碎方法对细胞破碎效果的影响，并对破碎后的细胞进行了显微镜观察和蛋白质含量测定。
2. 实验结果（1）显微镜观察在显微镜下观察发现，化学破碎、机械破碎和超声波破碎方法均能有效地破坏微生物细胞，使细胞内容物释放出来。
酶解破碎方法在低浓度酶解剂下，细胞破碎效果较差，但随着酶解剂浓度的增加，细胞破碎效果逐渐提高。
（2）蛋白质含量测定通过测定破碎后的细胞蛋白质含量，结果显示，化学破碎、机械破碎和超声波破碎方法对蛋白质含量的影响较小，而酶解破碎方法随着酶解剂浓度的增加，蛋白质含量逐渐降低。
3. 结果讨论（1）不同破碎方法对细胞破碎效果的影响化学破碎方法具有操作简便、成本低等优点，但可能对细胞内容物造成一定程度的污染。
机械破碎方法在破碎过程中，容易导致细胞内容物的机械损伤，影响后续实验结果。
超声波破碎方法具有破碎速度快、破碎效果好等优点，但设备成本较高。
酶解破碎方法具有特异性强、破碎效果好等优点，但酶解剂的选择和浓度对破碎效果有较大影响。
（2）细胞破碎效果与蛋白质含量的关系实验结果表明，不同破碎方法对蛋白质含量的影响较小。
这可能是由于细胞破碎过程中，细胞膜和细胞壁的破坏使得蛋白质释放出来，从而降低了蛋白质含量。
此外，酶解破碎方法随着酶解剂浓度的增加，蛋白质含量逐渐降低，这可能是因为高浓度的酶解剂导致蛋白质发生降解。
三、实验结论1. 化学破碎、机械破碎、超声波破碎和酶解破碎方法均能有效破坏微生物细胞，释放细胞内容物。
2. 酶解破碎方法在低浓度酶解剂下，细胞破碎效果较差，但随着酶解剂浓度的增加，细胞破碎效果逐渐提高。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
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第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
利用离心使酵母菌破碎的方法
利用离心使酵母菌破碎的方法
离心是一种分离和富集生物样品的常用方法，而在微生物学中，离心也可以用来破碎酵母菌细胞。
下面是利用离心使酵母菌破碎的方法：
1.培养酵母菌，并收集到需要处理的细胞。
2.将酵母菌细胞悬浮液离心，一般建议采用低速离心，避免对细胞壁造成损伤。
离心速度一般为3000-5000rpm，离心时间视具体情况而定。
3.将离心后的上清液倒掉，保留下混浊的沉淀。
这个沉淀就是破碎后的酵母菌细胞。
4.将酵母细胞沉淀洗涤几次，可以用PBS缓冲液或其他无菌的盐水进行洗涤。
洗涤后将酵母细胞沉淀在离心管底部。
5.加入适量的破碎缓冲液，使用超声波或高压破碎器进行破碎。
破碎缓冲液的成分视研究目的而定，一般包括酶抑制剂、缓冲液和蛋白酶等。
6.破碎后的酵母细胞，可以用离心或过滤的方法除去残留的细胞壁和细胞碎片，得到纯的酵母菌细胞内部物质。
总之，利用离心使酵母菌破碎，是一种简单易行、高效快捷的方法，可以用于酵母菌内部物质的提取和纯化。
- 1 -。
4第四章 微生物细胞的破碎
三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
1. 破碎率的测定
1)直接测定法
采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色， 2)目的产物测定法 而受损害的细胞呈亮红色。 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的 产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得 3)导电率测定法 的标准数值比较，计算其破碎率。 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上 升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加 。
转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎 细胞破碎与固液分离紧密相关。 同样条件下破碎率只有32%。 与上游培养过程有关。 用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的 。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环 丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬 菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。
作业:
1. 常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、 超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、 特点及适用性。 2. 举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎 率的机理。
二常用破碎方法类作用机理分适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率可较大规模操作大分子目的产物易失活浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率可大规模操作不适合丝状菌和含有包含体的基因工程菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差破碎过程升温剧烈不适合大规模操作xpress法固体剪切作用破碎率高活性保留率高对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性条件温和浆液易分离溶酶价格高通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性浆液易分离但释放率较低通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结融化破碎率较低不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈易引起大分子物质失活细胞破碎机理图进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠石英砂氧化铝等研磨剂直径小于1mm一起快速搅拌或研磨研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切剂珠子与细胞之间的互相剪切碰撞使细胞破碎释放出内含物
微生物细胞破碎原理与技术
对于含有酶的细胞破碎产物，酶的活性是评价产物质量的重要
指标。
细胞内重要代谢物
02
对于特定微生物细胞破碎产物，细胞内的重要代谢物的含量也
是评价产物活性的指标之一。
细胞免疫活性
03
对于具有免疫活性的细胞破碎产物，免疫活性是评价产物质量
的重要指标。
04
微生物细胞破碎技术的前景与挑战
微生物细胞破碎技术的发展前景
微生物细胞破碎的应用
80%
蛋白质提取
通过破碎微生物细胞，可以提取 和纯化细胞内的蛋白质，用于酶 工程、生物制药等领域。
100%
酶的提取
酶是微生物细胞中的重要组成部 分，通过破碎细胞可以提取各种 酶，用于催化化学反应和工业生 产。
80%
代谢产物的提取
微生物在生长过程中会产生许多 具有生物活性的代谢产物，通过 破碎细胞可以提取这些产物，用 于药物研发和生物技术领域。
颗粒物质，提高破碎效果；在破碎后进行后处理，如离心、过滤、纯化
等，提高产物的纯度和质量。
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破碎能耗
破碎过程中的能量消耗也是评价破碎效率的指标之一。
细胞破碎产物纯度评价
02
01
03
杂质含量
破碎产物中杂质的含量越低，产物的纯度越高。
蛋白质含量
破碎产物中蛋白质的含量也是评价产物纯度的指标之 一。
细胞内含物残留
破碎产物中细胞内含物的残留量越少，产物的纯度越 高。
细胞破碎产物活性评价
酶活性
01
微生物细胞破碎原理与技术
目
CONTENCT
录
• 微生物细胞破碎概述 • 微生物细胞破碎技术 • 微生物细胞破碎效果评价 • 微生物细胞破碎技术的前景与挑战
细胞的破碎名词解释
细胞的破碎名词解释细胞，作为生物体的基本组成单位，是生命存在和运作的基石。
然而，当细胞发生破碎时，也会引发一系列的复杂反应和生理变化。
本文将对细胞破碎所引发的一些重要现象进行解释和探讨。
细胞破碎，顾名思义，是细胞壁或膜的破裂，导致细胞内部的有机和无机物质散布到周围环境中。
这种破碎可以由外力作用、生物活动、疾病等多种因素引起。
当细胞破碎发生时，可以观察到许多有趣的现象和变化。
首先，细胞的破碎会导致释放细胞内部的胞内器官。
细胞内部的胞器官包括核糖体、线粒体、内质网等，它们在细胞内扮演着重要的角色。
而当细胞发生破碎时，这些胞器官会被释放到周围环境中。
这些被释放的胞器官可以提供重要的信息，并可能引发一系列的细胞应激反应。
其次，细胞破碎还会释放细胞内的胞质成分。
胞质是细胞内部的胶状物质，其中包含了丰富的营养物质和代谢产物。
当细胞发生破碎时，这些胞质成分会迅速散布到周围环境中，被周围细胞或微生物吸收和利用。
这在一定程度上促进了物质的循环和再利用，对生态系统的稳定发挥了积极作用。
此外，细胞破碎还会引起一系列的细胞死亡和疾病发生。
当细胞丧失完整的细胞膜或壁时，细胞的内外环境无法有效分离，导致细胞内外物质的混合。
这种混合可能导致细胞内产生有害的化学反应，进而加速细胞死亡及疾病的发展。
细胞破碎也为一些外来病原体提供了进入细胞的途径，增加了生物感染和疾病传播的风险。
除了上述现象外，细胞破碎还可能引发一系列信号传导和免疫反应。
当细胞破碎发生时，细胞内部的信号分子和细胞标识物会被释放到外部环境中。
这些信号分子可以激活周围细胞的反应，引发免疫反应和炎症过程。
这种反应有助于清除和消除细胞破碎产生的有害物质，保护组织和器官的正常功能。
总之，细胞的破碎是一个复杂而多变的过程，涉及到许多生理与病理过程。
从细胞内部结构的释放，到物质的循环利用，再到细胞死亡和疾病发生，以及信号传导和免疫反应，都是细胞破碎所带来的重要变化和现象。
对于这些变化的深入研究可以揭示细胞的功能和疾病的本质，为人们的健康提供更好的保障和解决方案。
生物工程实验中收菌和破碎的步骤
生物工程实验中收菌和破碎的步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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微生物细胞破碎原理与技术
酶解破碎
01
02
03
酶解破碎是利用酶分解细胞壁的 一种方法。酶能够特异性地分解 细胞壁中的蛋白质或糖类物质， 使细胞壁变得脆弱，最终破裂。
酶解破碎常用的酶有蛋白酶、糖 酶、胶原酶等。酶的种类和浓度、 反应温度、反应时间等因素都会 影响破碎效果。
酶解破碎的优点是破碎效果好、 细胞碎片小，适用于蛋白质、核 酸等生物大分子的提取。但缺点 是成本较高，需要严格控制反应 条件。
生物技术
利用基因工程和蛋白质工程技术 改造微生物细胞，提高细胞破碎 效率和产物的产量。
微流控技术
利用微流控芯片进行细胞破碎， 实现高通量、高效率和低能耗的 细胞破碎。
提高破碎效率和产物的纯度与活性
优化破碎条件
通过优化破碎条件，如压力、温度、破碎时间等，提 高破碎效率和产物的纯度与活性。
选择合适的破碎方法
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
通过微生物细胞破碎，可以研 究细胞内蛋白质的表达、定位 和功能，有助于深入了解细胞 的生理和病理过程。
微生物细胞破碎技术还可以用 于病毒的分离和纯化，以及疫 苗的制备和研究。
05
未来展望与挑战
新技术的研发与应用
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高细 胞破碎效率，减少能耗和成本， 同时提高产物的纯度和活性。
04
应用与实例
工业发酵过程中的应用
微生物细胞破碎在工业发酵过程 中主要用于提取和纯化胞内产物，
如酶、蛋白质、代谢产物等。
通过破碎微生物细胞壁，可以释 放出细胞内的物质，便于后续的
提取和纯化。
工业发酵过程中常用的细胞破碎 技术包括机械破碎、超声波破碎、
化学破碎等。
生物资源开发中的应用
微生物酶的分离纯化与酶学性质研究
微生物酶的分离纯化与酶学性质研究微生物酶在生物工程和生物技术领域具有广泛的应用，如食品工业、医药工业和环境工程等。
为了更好地利用微生物酶的功能，研究人员常常需要对微生物中的酶进行分离纯化和酶学性质的研究。
本文将介绍微生物酶的分离纯化方法和酶学性质的研究内容。
一、微生物酶的分离纯化方法微生物酶的分离纯化是指将微生物中的酶从其他组分中分离出来，并获得高纯度的酶样品的过程。
一般而言，微生物酶的分离纯化可以分为以下几个步骤：1. 细胞破碎：首先需要将微生物细胞破碎释放酶。
常见的破碎方法有超声波破碎、高压破碎和球磨破碎等。
2. 细胞层析：通过柱层析技术，可以将酶从细胞裂解液中进一步分离纯化。
常用的柱层析方法有凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。
3. 酶活测定：利用酶活测定方法可以确定酶的纯度和活力。
常用的酶活测定方法有酶促反应法、比色法和荧光法等。
二、微生物酶的酶学性质研究微生物酶的酶学性质研究是指对酶的催化活性、底物特异性、酶动力学参数和酶稳定性等进行研究。
这些研究可以为酶的应用提供理论依据。
1. 催化活性：通过测定酶在不同底物浓度和温度条件下的催化活性，可以确定酶的最适pH值和最适温度等。
2. 底物特异性：通过测试酶对不同底物的催化活性，可以确定酶对底物的特异性。
常用的方法有比色法、荧光法和质谱法等。
3. 酶动力学参数：通过测定酶在不同底物浓度下的催化速率，可以确定酶的酶动力学参数，如酶的最大催化速率和米氏常数等。
4. 酶稳定性：通过测定酶在不同pH值、温度和离子浓度等条件下的稳定性，可以确定酶的稳定性。
常用的方法有热失活曲线法、酶活测定法和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
结论微生物酶的分离纯化和酶学性质研究对于更好地利用酶的功能具有重要的意义。
通过适当的分离纯化方法可以获得高纯度的酶样品，而通过酶学性质的研究可以了解酶催化活性和特性，为酶的应用提供理论依据。
深入研究微生物酶的分离纯化和酶学性质，将有助于推动生物工程和生物技术的发展。
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细胞破碎。
高压匀浆器的排出阀
影响匀浆破碎的主要因素： 压力、温度、通过匀浆器阀的次数
不宜采用高压匀浆法的细胞类型。 易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包含体的基因工程菌
大、中、小型高压匀浆器
3.超声破碎法（Ultrasonication）
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液 体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极 大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。
➢ 影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温 度和粘度、处理时间等。
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国 西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。 珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。
胶体磨
德国进口珠磨机
第三节 细胞破碎
L/O/G/O
定义
• 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破
坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物
成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的 非分泌型生化物质（产品）的基础。
细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种生物 细胞壁的组成和结构。
生物类型 主要组成
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物
细胞的大规模处理中常采用
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环
植物细胞
初生壁 次生壁
细菌 破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结
构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母 葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚
糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构 交联的紧密程度和它的厚度；
霉菌 细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强
G+细菌
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
G-细菌
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
酵母菌
葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.513.5%）
霉菌
多聚糖（几 丁质） （80-90%） 脂类 蛋白质
酶分解作用 改变细胞膜的渗透
性 渗透压剧烈改变 反复冻结-融化 改变细胞膜渗透性
适应性 可达较高破碎率，可较大规模操作， 大分子目的产物易失活，浆液分离困 难 可达较高破碎率，可大规模操作，不 适合丝状菌和革兰氏阳性菌 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧 烈，不适合大规模操作 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏 感目的产物不适合 具有高度专一性，条件温和，浆液易 分离，溶酶价格高，通用性差 具一定选择性，浆液易分离，但释放 率较低，通用性差 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的 产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失 活
度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高；
植物细胞 次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物
细胞具有很高的机械强度。
常用破碎方法
分
类
机 珠磨法 械 法
高压匀浆 法
超声破碎 法
X-press法
非 酶溶法
机
械 法
化学渗透 法
渗透压切作用
液体剪切作用 液体剪切作用 固体剪切作用
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性 剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择 地渗透出来。
（1）表面活性剂
表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作 用有助于细胞的破碎。
➢Triton X-100 ➢牛黄胆酸钠 ➢十二烷基磺酸钠
（2）EDTA螯合剂
主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。
EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁 外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导 致内层膜通透性的增强。
（3）有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。
乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
➢ 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌 比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。
➢ 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。
非机械法
1.酶溶法（Enzymatic Lysis）
（1）外加酶法
常用的溶酶
溶菌酶 β-1，3-葡聚糖酶 β-1，6-葡聚糖酶 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶等
机械法
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英 砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅 拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、 碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器 的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而 实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷 却的方式带走。
（2）自溶法（Autolysis）
诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞 酶的活力，以达到细胞自溶的目的。
影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、 激活剂和细胞代谢途径等。
缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质 的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度 下降。
2.化学渗透法（Chemical permeation）
利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受 到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法 破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构 和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外 形完整。
酶溶法的缺点： 溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。