微生物细胞破碎汇总
常用的几种细胞破碎方法介绍
随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下。 1. 高压匀浆法 设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆间组成，美国Microfluidics公司和ATS公司均有产品出售。其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪刀，碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。 存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 2. 高速珠磨法 设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。 存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。 3. 超声破碎 频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。 存在问题；超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。 4. 酶溶法 就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 存在的问题；易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 5. 化学渗透法 某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 存在的问题；时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 本文介绍了几种细胞破碎的方法，可谓各有千秋，在实际应用中，应尽量考虑全面，选择最科学、有效的方法。
细胞破碎
细胞破碎
概述
虽然几乎所有的细菌都含有肽聚糖的网状结构，但是革兰氏
阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴 性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切片观察，可见革兰 氏阳性菌细胞壁较厚，具有20～80nm的肽聚糖层，约占细 胞 壁 成 分 的 40 ～ 90 ％ ， 此 外 细 胞 壁 还 含 有 大 量 磷 壁 酸 (eichoic acid)。而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～ 3nm，占细胞壁成分的10％左右，由于肽聚糖之间仅由四肽 侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于 细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较 厚的外壁层(约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其 它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。
细胞破碎
细胞破碎技术
高压匀浆法适用的范围
高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%左右。 ☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高 压匀浆法。
细胞破碎
细胞破碎技术
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２－３℃/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。 多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温 度上升，保护产物活性。
出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和 高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式
上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可 连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温 度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中， 对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常 采用多次循环的操作方法。
细胞破碎
细胞破碎技术
细胞破碎方法综述
细胞破碎方法综述细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。
结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法1前言目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。
破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。
自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。
很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。
因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。
2细胞破碎技术2．1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
细胞破碎(cell disruption)
细胞破碎（cell disruption）定义:细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化.1细胞壁的组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构细菌，肽聚糖的网状结构酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌：细胞壁更厚植物细胞壁的化学组成和结构初生壁，次生壁具有很高的机械强度2 细胞破碎技术机械法和非机械法2.1机械法机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法高压匀浆器影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。
高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.高速珠磨机(high spced bead mill) 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、pH值、菌体的种类和浓度也有很大的影响.超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种很好的方法2.2 非机械法非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等.1)酶解法是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。
酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。
酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广.渗透压冲击法冻融法干燥法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。
微生物细胞的破碎
❖ KOLER gmbh
❖ 德国著名特制合金材料公司
ATS的技术合作伙伴－意大利FBF
ATS的合作伙伴FBF
❖ 成立于1987年，位于意 大利帕尔马
❖ 2002年来，每年生产近 300台高压均质机
❖ 设备销往全世界50多个 国家，有超过2000台设 备在各地运行。
ATS的合作伙伴FBF
可达较高破碎率，可大规模操作，对于少 量物料<100ml,难操作
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
微生物 壁厚/nm 层次
主要组 成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 酵母菌
20-80
10-13
100-300
单层
多层
多层
肽聚糖
肽聚糖
葡聚糖
（40-90%） （5-10%） （30-40%）
多糖
脂蛋白
❖ 2002年开发了新的 TITAN系列大型高压均 质机，成为欧洲发展最 迅速的高压均质机制造 商。
高压细胞破碎机工作原理
❖ 电机驱动 ❖ 柱塞泵加压 ❖ 均质点破碎
❖ 空穴效应 ❖ 剪切效应 ❖ 撞击效应
破碎发生点
高压破碎的要点
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
浅谈常用细胞破碎方法
浅谈常用细胞破碎方法随着生物技术的逐渐发展，生物所产生的各种代谢产物也逐渐被人们发现其有用的一面，但是在获得目的产物过程中，往往因为不同产物所处的生物个体不同，造成了个体差异性，所以为了获得大量，不被破坏的产物，往往针对不同生物个体选用不同的细胞破碎技术来做预处理。
现将几年来一直常用的细胞破碎技术介绍一下：关键词：细胞破碎机械法酶法（一）细胞破碎的定义1.细胞破碎（cell rupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
2.破碎各种细胞的主要阻力：2.1破碎细菌细胞的主要阻力：肽聚糖网状结构的致密程度和强度，取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度;2.2 破碎酵母细胞的阻力:葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度;2.3 破碎霉菌细胞的阻力:葡聚糖网状结构的交联度,几丁质或纤维素的纤维状结构。
(二) 细胞破碎的方法1.机械法1.1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器（High pressure homogenizer）操作原理：在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
操作方式：单次或多次循环出口温度：20℃左右压力：55－70Mpa适用范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。
料液细胞浓度：20%左右。
☆团状和丝状菌，不宜使用。
注意事项：（1）操作温度：↑２－３℃/10MPa（2）对料液作冷却处理。
（3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。
（4）较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合该法处理【1】。
1.2珠磨机研磨珠磨机研磨：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
工作原理：细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起，磨室配有冷却夹套。
注意事项：操作参数较多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30%左右。
细胞破碎实验报告结论
一、实验目的总结本次实验的主要目的是研究不同细胞破碎方法对微生物细胞破碎效果的影响，探讨不同破碎方法在微生物细胞提取中的应用前景。
通过对实验结果的观察和分析，旨在为微生物细胞破碎实验提供科学依据，为后续研究提供参考。
二、实验结果分析1. 实验材料及方法实验选用了一种常见的微生物细胞，采用化学破碎、机械破碎、超声波破碎和酶解破碎四种方法进行细胞破碎。
在实验过程中，分别记录了不同破碎方法对细胞破碎效果的影响，并对破碎后的细胞进行了显微镜观察和蛋白质含量测定。
2. 实验结果（1）显微镜观察在显微镜下观察发现，化学破碎、机械破碎和超声波破碎方法均能有效地破坏微生物细胞，使细胞内容物释放出来。
酶解破碎方法在低浓度酶解剂下，细胞破碎效果较差，但随着酶解剂浓度的增加，细胞破碎效果逐渐提高。
（2）蛋白质含量测定通过测定破碎后的细胞蛋白质含量，结果显示，化学破碎、机械破碎和超声波破碎方法对蛋白质含量的影响较小，而酶解破碎方法随着酶解剂浓度的增加，蛋白质含量逐渐降低。
3. 结果讨论（1）不同破碎方法对细胞破碎效果的影响化学破碎方法具有操作简便、成本低等优点，但可能对细胞内容物造成一定程度的污染。
机械破碎方法在破碎过程中，容易导致细胞内容物的机械损伤，影响后续实验结果。
超声波破碎方法具有破碎速度快、破碎效果好等优点，但设备成本较高。
酶解破碎方法具有特异性强、破碎效果好等优点，但酶解剂的选择和浓度对破碎效果有较大影响。
（2）细胞破碎效果与蛋白质含量的关系实验结果表明，不同破碎方法对蛋白质含量的影响较小。
这可能是由于细胞破碎过程中，细胞膜和细胞壁的破坏使得蛋白质释放出来，从而降低了蛋白质含量。
此外，酶解破碎方法随着酶解剂浓度的增加，蛋白质含量逐渐降低，这可能是因为高浓度的酶解剂导致蛋白质发生降解。
三、实验结论1. 化学破碎、机械破碎、超声波破碎和酶解破碎方法均能有效破坏微生物细胞，释放细胞内容物。
2. 酶解破碎方法在低浓度酶解剂下，细胞破碎效果较差，但随着酶解剂浓度的增加，细胞破碎效果逐渐提高。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
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第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
经典：第三章-微生物细胞破碎
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一、细菌细胞壁 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成份，
它是一个大分子复合体，由多糖链借短肽 交链而成。
细菌破碎的主要阻力来自肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取 决于多糖链上存在的肽键数量和其交链程 度，交链程度越大，网状结构越致密，破 碎难度越大。
8
革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图
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微生物细胞的自溶法常采用加热法或 干燥法。
工业生产的典型例子是酵母自溶物制 备。
自溶法的缺点：对不稳定的微生物， 易引起目的蛋白质的变性，此外，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。
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五、化学渗透法(Chemical permeation)： 利用一些化学试剂，如有机溶剂、变性
剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等， 以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从 而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理 方式称为化学渗透法。
中试规模：胶质磨 工业规模：高速珠磨机
22
破碎作用符合一级动力学； 破碎程度用细胞破碎率（%）或单位细 胞释放的内含物（mg/g）表示。
23
细胞破碎动力学方程：
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延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌 转速和操作温度等都可有效地提高细胞破 碎率。
高破碎率将大大增加能耗；温度升高； 大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不 易分离。
图革 兰 氏 阳 性 菌 细 胞 壁 结 构 模 式
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二、酵母菌细胞壁： 酵母菌细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主
要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、 蛋白质（6-8%）和脂类。
酵母细胞壁结构可分成三层：最里层葡聚糖层， 构成细胞壁的刚性结构，使细胞具有一定的形状； 最外层是甘露聚糖层；葡聚糖层和甘露聚糖层依 靠处于中间层的蛋白质交链在一起，形成网状结 构。
微生物细胞破碎原理与技术
对于含有酶的细胞破碎产物，酶的活性是评价产物质量的重要
指标。
细胞内重要代谢物
02
对于特定微生物细胞破碎产物，细胞内的重要代谢物的含量也
是评价产物活性的指标之一。
细胞免疫活性
03
对于具有免疫活性的细胞破碎产物，免疫活性是评价产物质量
的重要指标。
04
微生物细胞破碎技术的前景与挑战
微生物细胞破碎技术的发展前景
微生物细胞破碎的应用
80%
蛋白质提取
通过破碎微生物细胞，可以提取 和纯化细胞内的蛋白质，用于酶 工程、生物制药等领域。
100%
酶的提取
酶是微生物细胞中的重要组成部 分，通过破碎细胞可以提取各种 酶，用于催化化学反应和工业生 产。
80%
代谢产物的提取
微生物在生长过程中会产生许多 具有生物活性的代谢产物，通过 破碎细胞可以提取这些产物，用 于药物研发和生物技术领域。
颗粒物质，提高破碎效果；在破碎后进行后处理，如离心、过滤、纯化
等，提高产物的纯度和质量。
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感谢聆听
破碎能耗
破碎过程中的能量消耗也是评价破碎效率的指标之一。
细胞破碎产物纯度评价
02
01
03
杂质含量
破碎产物中杂质的含量越低，产物的纯度越高。
蛋白质含量
破碎产物中蛋白质的含量也是评价产物纯度的指标之 一。
细胞内含物残留
破碎产物中细胞内含物的残留量越少，产物的纯度越 高。
细胞破碎产物活性评价
酶活性
01
微生物细胞破碎原理与技术
目
CONTENCT
录
• 微生物细胞破碎概述 • 微生物细胞破碎技术 • 微生物细胞破碎效果评价 • 微生物细胞破碎技术的前景与挑战
微生物细胞的破碎
穴清除，特别是应用高的功率时。
(4)、被处理悬浮液的体积
大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。
(5)、珠粒的体积和直径
添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的 形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提 高破碎效率。
在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k存
在最大值。
(6)、探头的形状和材料
结构：最里层是由葡聚糖的 细纤维组成，它构成了细胞壁 的刚性骨架，使细胞具有一定 的形状，中间是一层糖蛋白， 再外面是网状结构的甘露聚糖。 破碎阻力主要决定于壁结 构交联的紧密度和壁厚度。
（三）、其他真菌的细胞壁
大多数真菌的细胞壁主要由多糖组成，其次还含有 较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有 很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡 聚糖构成。 真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅 如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强 度有所提高。
以达到自溶的目的。
影响因素：有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢 途径等。 方法：微生物自溶常采用加热法或干燥法。
举例： 1、谷氨酸产生菌，可加入0.028mol／L Na2CO3和 0.018mol／L NaHCO3 ，pH10的缓冲液，使成3％的悬浮 液，加热至70C，保温搅拌20分钟，菌体即自溶。 2、酵母自溶温度需在45—50C下保持12—24小时。
压和高速冲击撞击环造成 细胞破碎。
多次循环 对酵母菌等难破碎的及浓度高或处于静止期的细胞， 常采用多次循环。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎 的细胞分率符合下式公式：
影响破碎的主要因素：压力、温度和通过匀浆器阀的次数。 压力：升高压力有利于破碎， Brokman研究了能适应于高压 操作的匀浆器，试验表明在约 175MPa的压力下，破碎率可 达100％，但是也有试验表明 当压力超过一定的值后，破碎 率增长得很慢。
第4章 微生物细胞破碎
2.植物细胞壁的化学组成和结构 植物细胞壁的化学组成和结构
成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁， 成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 细胞不再增大。 细胞不再增大。 初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 纤维素分子又可进一步组装成微纤丝， 纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。
（3）超声波破碎法 ）
影响超声波破碎的因素主要有超声波的声 强、频率、破碎时间、介质的离子强度、 频率、破碎时间、介质的离子强度、 pH、菌体的浓度和种类。 、菌体的浓度和种类。 一般杆菌比球菌易破碎， 细菌比G 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比 +细菌 易破碎，对酵母菌的效果较差。 易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时 细胞浓度一般在20％左右。 细胞浓度一般在 ％左右。
按细胞所受作用） 第二节 常用破碎方法（按细胞所受作用）
分 类 作用机理 适应性 可达较高破碎率，可大规模操作， 可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌 可达较高破碎率，可较大规模操作， 可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活， 分子目的产物易失活，浆液分离困难 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作 破碎率较低， 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低， 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物 条件变化剧烈， 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 破碎率高，活性保留率高， 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合 具有高度专一性，条件温和， 具有高度专一性，条件温和，浆液易分 溶酶价格高， 离，溶酶价格高，通用性差 具一定选择性，浆液易分离， 具一定选择性，浆液易分离，但释放率 较低， 较低，通用性差 高压匀浆法 液体剪切作用 珠磨法 固体剪切作用
常用的细胞破碎方法
常用的细胞破碎方法
常用的细胞破碎方法：
①冻融法通过反复冷冻融化细胞使细胞膜受到应力作用破裂释放胞内物质适用于酵母细菌等微生物细胞；
②机械研磨使用玻璃珠不锈钢珠等硬质颗粒在高速旋转下与细胞发生剧烈撞击摩擦导致细胞壁破坏；
③超声波破碎将细胞悬液置于超声探头附近开启超声波发生器利用空化效应产生的强烈剪切力击碎细胞；
④高压匀浆将细胞混悬液泵入高压容器中瞬间释放压力使细胞在强烈湍流下解体适用于多数类型细胞；
⑤酶解消化利用纤维素酶果胶酶等特定酶类降解植物细胞壁多糖成分从而使细胞内容物流出；
⑥化学溶解加入表面活性剂如SDS Triton X-100等破坏细胞膜脂双层稳定性导致细胞崩解；
⑦渗透冲击将高渗培养的细胞突然转移到低渗缓冲液中由于渗透压差引起细胞急剧膨胀破裂；
⑧电穿孔技术通过瞬间施加高压脉冲电场改变细胞膜通透性促使细胞内容物外泄常用于难破碎细胞；
⑨物理挤压将细胞通过微孔滤膜或狭窄管道时受到强烈挤压变形超过一定限度后细胞就会破碎；
⑩激光辐射利用聚焦激光束直接照射细胞表面产生的热效应及机械效应共同作用下破坏细胞完整性；
⑪微波处理将细胞暴露在微波场中由于水分子强烈振动产热加速细胞内部压力积累最终导致破裂；
⑫最后值得注意的是无论采用哪种方法都需要根据具体实验目的选择最合适的条件组合以达到最佳效果。
微生物细胞破碎原理与技术
酶解破碎
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酶解破碎是利用酶分解细胞壁的 一种方法。酶能够特异性地分解 细胞壁中的蛋白质或糖类物质， 使细胞壁变得脆弱，最终破裂。
酶解破碎常用的酶有蛋白酶、糖 酶、胶原酶等。酶的种类和浓度、 反应温度、反应时间等因素都会 影响破碎效果。
酶解破碎的优点是破碎效果好、 细胞碎片小，适用于蛋白质、核 酸等生物大分子的提取。但缺点 是成本较高，需要严格控制反应 条件。
生物技术
利用基因工程和蛋白质工程技术 改造微生物细胞，提高细胞破碎 效率和产物的产量。
微流控技术
利用微流控芯片进行细胞破碎， 实现高通量、高效率和低能耗的 细胞破碎。
提高破碎效率和产物的纯度与活性
优化破碎条件
通过优化破碎条件，如压力、温度、破碎时间等，提 高破碎效率和产物的纯度与活性。
选择合适的破碎方法
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通过微生物细胞破碎，可以研 究细胞内蛋白质的表达、定位 和功能，有助于深入了解细胞 的生理和病理过程。
微生物细胞破碎技术还可以用 于病毒的分离和纯化，以及疫 苗的制备和研究。
05
未来展望与挑战
新技术的研发与应用
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高细 胞破碎效率，减少能耗和成本， 同时提高产物的纯度和活性。
04
应用与实例
工业发酵过程中的应用
微生物细胞破碎在工业发酵过程 中主要用于提取和纯化胞内产物，
如酶、蛋白质、代谢产物等。
通过破碎微生物细胞壁，可以释 放出细胞内的物质，便于后续的
提取和纯化。
工业发酵过程中常用的细胞破碎 技术包括机械破碎、超声波破碎、
化学破碎等。
生物资源开发中的应用
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击板，得以破碎。
喷雾撞击破碎特点
喷雾撞击特点：
（1）细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬，细胞破碎 度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎现象。
（2）细胞破碎程度可通过无极调节载气压力（流速）控 制，避免胞内结构的破坏，适用于细胞器（叶绿体、 线粒体）的回收。
不宜采用高压匀浆法的细胞类型：
易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
思考问题： 比较高压匀浆法与珠磨法的异同点？
3.喷雾撞击破碎
细胞弹性体 刚性体
喷雾撞击破碎器结构简图
3.喷雾撞击破碎
细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（每分钟数千摄氏度）， 形成粒径小于5微米的微粒子。高速载气，氮气流速 300m/s，将冻结的微粒子送入破碎室，高速冲向撞
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下： 降低能耗 减少大分子目的产物的失活 减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易 分离而给后续操作带来的困难。
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization） ——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同， 由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如霉菌、 酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。
二、常用破碎方法
分 类 作 用 机 理
固体剪切作用
适
应
性
珠磨法 机 械 法 高压匀浆法 超声破碎法 X-press法
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难
多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密 程度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
液体剪切作用
液体剪切作用 固体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和含有包含体的基因工程菌
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离， 非 溶酶价格高，通用性差 机 械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较 低，通用性差 法 渗透压法 冻结融化法 干燥法 渗透压剧烈改变 反复冻结-融化 改变细胞膜渗透性 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
第四章
微生物细胞的破碎
知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞 的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法 的原理，操作过程及常用设备，并能就实际 生产情况予以合理的选择。
难点：常用破碎方法的合理选用。
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
高压匀浆器
大、中、小型高压匀浆器
操作条件的选择：
珠体大小——根据细胞大小、浓 搅拌转速——过高将 度以及连续操作时不使珠体带出 使能量消耗大增，而 来选择。 破碎率上升不明显。 珠体装量——装量少时，细胞不 能耗 易破碎；装量大时，能量消耗大， 研磨室热扩散性能降低，引起温 度升高。 R 温度——温度高时细胞较易破碎， 但要考虑目的产物不受破坏。一 般温度控制在5～40℃内时影响 较小。 n
破碎的动力学方程为：ln[1／（l－R）]＝KNPα 其中 R——破碎率； K——与温度有关的速度常数； P一操作压力； N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。 α——与微生物种类有关的常数； 破碎酵母菌,α值可取2. 2。可见，影响破碎的主要 因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度 的细胞，常采用多次循环的操作方法。 一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较 处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的 细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。
微生物
壁厚/nm 层次
革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌
20-80 单层 10-13 多层
酵母菌
100-300 多层
霉菌
100-250 多层
主要组 成
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.513.5%）
细胞破碎机理图
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放 出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹 套冷却的方式带走。
高速珠磨机
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速 组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士 WAB公司和德国西门子机械公司制造）。
胶体磨
德国进口珠磨机
破碎作用方程
破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合 下列公式： ln[1/(1-R)]=Kt 其中 R — 破碎率； K一 一级反应速度常数； t一 时间。 一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如如 搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃 小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。