植物单细胞培养概论

3、看护培养法
• 3-1 看护培养的含义及用途 • 含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 • 用途；诱导形成单细胞系。 • Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞 株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花 粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。
看护培养（Nurse culture）图示：
1、起始悬浮液的制备
转速30-150rpm
防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
2、悬浮培养的基本形式 、
分批培养 连续培养
2-1、分批培养（Batch culture） 2.1.1 含义：将愈伤组织培养在一定 容积的密闭容器中进行培养。它是进行 细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常 用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定时间 后，需要继代转移。
2.1.2 特点
• 培养基体积固定 • 培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈S增长。 • 必须适当搅拌
2-2 连续培养（Continuous culture)
2.2.1 含义：是相对分批培养而言的。连续培养是 采用有效的措施让微生物在某特定的环境中保 持旺盛生长状态的培养方法. 2.2.2 特点:：①高效，它简化了装料、灭菌、出 料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了 非生产时间和提高了设备的利用率；②自控， 便于利用各种仪表进行自动控制；③产品质量 较稳定；④节约了大量动力、人力、水和蒸汽， 且使水、汽、电的负荷均匀合理。
3-4 特点： 1）效果好，易于成功。 2）简便易行。 3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过 程。 • 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料 是真正的单细胞。 • • • •
4、微室培养法
4-1 微室培养的含义及用途 • 含义：即将细胞培养在很少量的培养基中。 • 用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形 成细胞团的过程。
植物单细胞培养概论
一、植物单细胞培养相关概念
• 1、植物的单细胞培养： 在适宜的条件下，一个来自已分化的根、 茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以 发育成同其亲本一样的完整植株。 植物组织培养技术的重要理论基础是植 物细胞的全能性 植物的单细胞培养，在无菌和人为控制 外因的条件下，培养、研究植物组织器官， 甚至进而从中分化、发育出整个植株的技 术。
恒温培 养1个月 个月
Single cell Filter paper Nurse callus
2~3月 月
单细胞无性系
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织
3-2
看护培养基本技术
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培 养基，灭菌后备用。 （2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活 跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤 组织块上放一片（1cm²）已灭菌的滤纸，然后 放置一个晚上。 （3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤 纸上。 （4）恒温培养。
三、细胞培养的主要内容
1、单细胞培养（Single cell culture） 2、悬浮培养（Suspension culture ） 3、细胞培养实验室器材 简介
第一节：单细胞培养 （Single cell culture）
• 单细胞的分离 • 单细胞的培养方法 • 影响单细胞培养的因子
单细胞的分离
固体培养基
2-2 特点 •操作简便； •分离单细胞系比液体浅层培养容易； •培养细胞气体交换不畅。
2-3
平板培养的基本技术
(1)、培养基配制 1.4%琼脂基本培养基+等量 细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。 （2）悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最 初细胞密度（即初始植板密度）为1×10 ³~ 100×10 ³ 个/ml 。 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细 胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
1、培养基成份
2、初始细胞植板密度(>临界密度)
•临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培 养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是 临界密度。 •初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养 基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。 一般要求每毫升在1000个细胞以上。 •其他：植物生长激素、温度、PH、二氧化碳含量等
通过原生质体再生法获取单细胞
外植体、愈伤组织或细胞团通过纤维素酶和果胶酶等 的作用，除去细胞壁得到原生质体。
单细胞培养培养方法
•液体浅层培养法 •固体平板培养法 •看护培养法 •微室培养法
1、液体浅层培养法
将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细 胞和小细胞团 培养在浅层液体培养基中
液体培养基 用途：主要用来增殖细胞。
• 若悬浮液与培养基以1:4混合，则应把悬浮液 的细胞密度调到 5×10 ³~ 500×10 ³ 个/ml。
•调制方法：若悬浮液中细胞密度高，则加培 养液稀释；若悬浮液中细胞密度过低，则通 过离心使细胞沉淀后，取一定量的上清液使 其达到所要求的密度。
• （3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成 平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。 • (4) 培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微 镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板 效率（也称植板率）。
第二节：细胞悬浮培养 Suspension culture
概念：是指离体的植物细胞悬浮在液体培养 基中进行无菌培养。由愈伤组织液体培养技 术发展而来。
特点： 特点： • 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适 于大规模培养； • 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生 长、分化创造方法和条件。 必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
电炉
推车
酒精灯
封口膜
接种器具
灭菌器
培养瓶
3.培养设备 培养设备
①带日光灯的培养架 培养架，主要用于接种后材料的培养。 培养架
②恒温箱：又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保 温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。
③摇床与转床 摇床与转床：在液体培养基中，可改善培养基中的培 摇床与转床 养材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个细 胞。但注意要设定适合的温度及转速。
•（1）微室内不能有气泡。 •（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖 玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。 •（3）观察时要保持温度和培养时的一致。
三、影响单细胞培养的因子
植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的 培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子 汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化学不明确物质；
that‘s
all!
微室培养（Microculture）图示：
凹穴载玻片
1滴含单细胞培养 滴含单细胞培养 液
周围加石蜡油
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
置培养皿中26~28 ℃恒 温培养
平视图
4-2
微室培养特点：
•培养基用量少 •可通过显微镜观察单个细胞的生长分裂、发育状 况 •有利于对细胞特性和单个细胞的生长发育的全过 程进行跟踪研究 •4-3 微室培养要求：
• 植板效率（或植板率）：已形成细胞团的 百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有 多少个能长出细胞团）。 • 每个平板上形成的细胞团数 • 植板效率= ×100%
该平板上接种的细胞数
2-4 平板培养必须注意的方面
• （1）选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是 能够在低的初始植板密度下使细胞生长。 • （2）不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分 裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。 • （3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种 类而不同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 ³ 个 /ml,若低于此数则植板率显著下降。 • （4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。
特点：
• • • • 有利于有毒物质的扩散； 有利于气体交换； 不利于定点观察； 单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。
2、固体平板培养法
• 2-1 含义及用途： • 含义： 是将单个细胞与融化的琼脂培养基 均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养 方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。 • 用途：是为了分离单细胞无性系，研究其 生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细 胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及 融合产物的培养。
• 2、愈伤组织： 原指植物体受伤时产生于 伤口周围的组织。现多指切取 植物体的一部分，置于含有生 长素和细胞分裂素的培养液中 培养，诱导产生的无定形的组 织团块。 • 3、外植体： 把由活植物体上切取下来 以进行培养的那部分组织或器 官叫做外植体
愈伤组织例图
二、植物组织培养特点及其意义
特点： ①培养条件可以 人为控制 ②生长周期短，繁殖率高 ③管理方便，利于工厂化 生产和自动化控制 • 意义：①研究细胞生理代 谢过程及各种影响因子； ②用于植物品种的改良； ③用于植物次生代谢物质 的生产 •
第三节 细胞培养实验室器材 简介
• 1.灭菌设备：高压蒸 灭菌设备： 灭菌设备 气灭菌锅 • 用于培养基、蒸馏水 和接种器械的灭菌消 毒。 • 工作原理：在密闭的 工作原理： 蒸锅内，0．1MPa的 压力下，锅内温度达 121℃。在此蒸气温 度下，可以很快杀死 各种细菌及其高度耐 热的芽孢。
2.接种设备：无菌超净工作台 接种设备： 接种设备 用于培养材料的消毒及接种。 使用前，将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭 菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面 进行操作。
• 从外植体中直接分离单细胞 机械法：第一种方法：用刀片刮叶片 第二种方法：叶片研碎、离心 酶解法： * 叶片是分离单细胞的最好材料 * • 从愈伤组织中分离单细胞 • 通过原生质体再生法获取单细胞
机械法第一种方法： 用刀片刮叶片 机械法第一种方法：
撕去下表皮
露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
机械法第二种方法：叶片研碎、离心
加研磨介质
研碎成粉 过滤、 过滤、离心
酶解法
Takebe等 1968）最早报道： Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处 理可以分离大量的叶肉细胞
加果胶酶
Fra Baidu bibliotek
过滤、 过滤、离心
从愈伤组织中分离单细胞
将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团伙单细 胞，然后用适当孔径的细胞筛过滤，除去大的细胞团和残渣， 离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。