环境微生物学2-2细菌革兰氏染色
实验二、细菌的简单染色与革兰氏染色
2、掌握好乙醇脱色时间。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2021/8/5
6
2021/8/5
7
葡萄球菌
2021/8/5
8
杆菌
2021/8/5
9
五、实验数据及处理结果
1、根据油镜观察结果，绘出普通变形杆菌和表皮 葡萄球菌的简单染色形态图。 2、列表简述普通变形杆菌和表皮葡萄球菌的革兰 氏染色油镜观察结果（菌的形态、颜色、革兰氏染 色反应）。
G-菌：细胞壁薄，肽聚糖含量低，类脂含量高，肽聚糖 分子交松散，故经乙醇处理后，壁会出现较大的缝隙， 细胞透性增大，结晶紫－碘复合物易被洗脱出来，再经 番红复染后使细胞显红色。
2021/8/5
4
三、实验器材
1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌 2、染色剂：简单染色液(吕氏碱性美蓝染液)；革兰氏 染色液（草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、 番红染液） 3、仪器或其他用具：载玻片、生理盐水、酒精灯、接 种环、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、滤纸等
细菌产酸使培养基pH下降时，细菌带正电荷增
加，可采用酸性染料。酸性染料有：伊红、酸性复
红、刚果红等。
2021/8/5
3
2、革兰氏染色
革兰氏染色是采用二种染料对细菌细胞进行染色， 初染采用的是结晶紫，复染采用的是番红。
G＋菌：细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，基本不含类脂， 肽聚糖分子交联度较紧密，故经乙醇处理后，肽聚糖网 孔因脱水而明显收缩，使壁的通透性降低保留着结晶紫 －碘复合物，所以复染液番红不能进入,细胞显紫色。
2021/8/5
5
四、操作步骤
1、简单染色
涂片
加热干燥固定
染色 1min 水洗
干燥
镜检
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
实验二 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
实验二细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习微生物涂片、染色的基本技术，学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。
革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤基本流程：涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
1.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
常规涂片法：取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色名词解释
革兰氏染色名词解释革兰氏染色（Gram staining）是一种常用的细菌鉴定和分类方法，由丹麦细菌学家克里斯蒂安·格拉默（Christian Gram）于1884年首次提出，并被广泛应用于临床微生物学和实验室研究中。
革兰氏染色的原理是通过对细菌细胞壁的染色特性进行区分。
细菌的细胞壁在结构上分为两种类型：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有厚实的胞壁，其细胞壁主要由多聚肽和多糖组成，对革兰氏染色染料结构相对稳定。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，含有一个内膜和一个较薄的胞壁，对革兰氏染色染料结构不稳定，容易被清洗脱色。
革兰氏染色方法通常由紫晶染液（crystal violet)、碘液（iodine）、酒精脱色液（ethyl alcohol）和洗净液（wash buffer）组成。
以下是革兰氏染色的步骤：1. 取一块无菌玻璃片，用手套或钳子夹住，然后在玻璃片上滴加一滴样本（可以是细菌培养物或分离纯培养的菌液），将细菌均匀涂抹于玻璃片上形成细菌涂片。
2. 将预先烘干的细菌涂片放置在静止的温和热环境中，使菌液完全固定在玻璃片上。
3. 将预热的紫晶染液倒在细菌涂片上，让染液覆盖整个细菌涂片，静置片上1分钟。
4. 倒掉多余的紫晶染液，用洗净液将染液冲干净。
5. 加一倍稀释的碘液在细菌涂片上，静置片上1分钟。
6. 倒掉多余的碘液，用洗净液将碘液冲洗干净。
7. 用酒精脱色液滴在细菌涂片上，进行制片人定时（通常为15-30秒），直到底色变得非常浅。
8. 倒掉酒精脱色液，用洗净液将细菌涂片冲干净。
9. 加入红粉溶液，让染料覆盖细菌涂片，静置片上1分钟。
10. 倒掉多余的红粉溶液，用洗净液将细菌涂片洗净，待片子晾干。
观察结果时，革兰氏阳性菌会呈现出紫色或蓝色，因为其细胞壁能够保留紫晶染料和碘复合物的结晶。
而革兰氏阴性菌则会呈现出红色或粉红色，因为其细胞壁无法保留紫晶染料和碘复合物的结晶，在酒精脱色过程中已经被去除。
2023 环境工程微生物学试题及答案
2023 环境工程微生物学试题及答案2023 环境工程微生物学试题及答案(一)一、名词解释(每题 1、5 分，计 30 分)类病毒：是一个裸露的闭合环状 RNA 分子，它能在感染寄主细胞并在其中进行自我复制使寄主产生病症。
异染粒：分散在细胞质中的多聚磷酸盐颗粒。
细胞壁：细胞壁是包在细菌细胞表面、内侧紧贴细胞质膜的较为坚韧并略具弹性的结构。
半知菌：还不知道是否有有性繁殖阶段的真菌。
锁状联合：是担子菌的次生菌丝为确保子细胞都含有________于父母亲本的核而进行的特殊的分裂方式。
无氧呼吸：以无机物作为最终电子受体，进行有机物的生物氧化的过程。
主动运输：是微生物中的主要运输方式，在代谢能和载体的参与下可进行逆浓度梯度的运输。
表面活性剂：具有降低表面张力效应的物质叫做表面活性剂。
它改变细胞的稳定性和透性，使细胞内的物质逸出细胞外，从而引起微生物的死亡。
互生：两个群体相互协作，达到在某一生境中共同生存的目的。
碱基配对：核酸分子中嘌呤碱基和嘧啶碱基配对互补。
DNA 聚合酶：以反向平行的 DNA 链为模板催化合成新链 DNA。
生物圈：是地球表面进行生命活动的有机圈层，包括了生活于大气圈下层、水圈、岩石圈以及三圈界面的所有生命体。
活性污泥：具有活性的微生物絮凝体。
氨化作用：是指有机态 N 被微生物降解形成NH3 的过程。
细胞膜：是围绕在细胞质外面的双层膜结构。
污泥容积指数：在暴气池出口处的混合液，经过 30 分钟静沉后，每克干污泥所形成的沉淀污泥的体积。
优势菌种挂膜法：将优势菌种附着在滤料上，以废水中的有机物为营养生长繁殖，使之形成生物膜的方法。
生态系统：是生物群落与其生存环境组成的整体系统。
生物絮凝剂：是一类具有絮凝作用的微生物产生的代谢产物。
废气的微生物滴滤法：用微生物挂膜的生物填料上方喷淋循环水，当废气中的有机污染物经过填料时，被挂膜的微生物分解的过程。
二、是非题(每题 1 分，计 10 分)1、病毒有抗青霉素的效应，因它们不具有基因组。
环境微生物学-实验二 微生物的染色
实验二微生物染色一、实验目的1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法；2、学习用压滴法制作标本片；3、学习微生物染色的原理；4、学习微生物涂片、染色的基本技术。
二、实验仪器和材料显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯；美蓝染液，草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液；酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌。
三、染色原理微生物（尤其是细菌）的机体小且是无色透明的，在活体细菌内又含有大量的水分。
因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。
当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有明显的明暗差，难以看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。
通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，在显微镜下观察。
微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成的，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。
两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性，带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性，带负电。
经测定，细菌的等电点pI在pH=2~5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH > 7）或偏酸性（pH=6~7）溶液中，细菌等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的居多。
碱性染料并不是碱而是一种盐，电解时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合，而使细菌着色。
碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红（沙黄）等。
微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。
四、染色方法1、简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
常用的简单染色染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红（沙黄）等。
2、革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阴性细菌（G－）和革兰氏阳性细菌（G+）。
环境工程微生物学实验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别穿刺接种大肠杆菌和变形杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h 3、柠檬酸盐利用试验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别划线接种大肠杆菌和枯草杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h
四、实验结果观察与记录
1、将实验结果填入下表，＋表示阳性，－表示阴性。 2、思考题：微生物生理生化反应的意义何在？
三操作步骤1微生物大小的测量1枯草杆菌标本片的制作2目镜测微尺的标定放置镜台测微尺放置目镜测微尺校正目镜测微尺计算不同放大倍数下目镜测微尺每格代表的长度3枯草杆菌大小的测量四实验报告1将目镜测微尺校正结果填入下表接物镜接物镜倍数目镜测微尺目镜测微尺每格代表的长度2在高倍镜下测量枯草杆菌大小的实验结果填入下表菌体编号长度的目镜测微尺格数宽度的目镜测微尺格数平均值菌体大小平均值m3分析实验结果一实验目的明确显微镜计数的原理
酵母菌的形态构造
线 粒 体 芽体液泡 芽 体 核 液 泡 膜 细 胞 壁 细 胞 膜
根霉（Rhizopus)
青霉（Penicillum):
曲霉(Aspergillus)
四、实验报告
1. 分析实验结果，绘制酵母菌、青霉、黑曲霉的形
态图，并注明各部位名称，。 2. 怎样才能观察到较为完整的霉菌形态，各种霉菌 制片过程中分别有哪些注意事项？
121℃,灭菌20~30min
使用时, 将培养基加热融化, 待温度降至50 ℃左右时在 100mL培养基中加入1%链霉素0.3mL
糖发酵培养基：
蛋白胨2g，葡萄糖10g， K2HPO4 0.2g, NaCl 5g, 琼脂5～6g， pH7.0～7.2 ，蒸馏水1L ， 1%溴百里酚蓝 3ml. 分装试管，每管4～5cm， 112℃,灭菌30min.
成信工环境工程微生物学实验指导02微生物的染色技术
实验二微生物的染色技术一、实验目的（一）了解微生物的染色原理。
（二）学习微生物涂片染色操作技术。
（三）掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。
二、染色原理微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。
通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。
革兰氏染色法（复染色法或鉴别染色法）用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。
主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。
抗酸性染色法多在医学上采用。
此处介绍革兰氏染色法。
革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法，它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
革兰染色结果是由细菌的细胞壁决定的。
革兰阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高且呈网状结构，细胞壁较厚，类脂质含量低；革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量低，细胞壁薄，类脂质含量高。
前者用酒精脱色时，细胞壁因脱水肽聚糖层网孔变小，其通透性降低，使结晶紫-碘的复合物不易被抽取而继续留在细胞内，经脱色和复染后仍保留着初染剂结晶紫的颜色（紫色）；后者用酒精脱色时，类脂质被酒精溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫-碘的复合物易被抽取出来，紫色褪去，用复染剂复染后，细胞的颜色即呈复剂的颜色（红色）。
革兰染色最关键的步骤是酒精脱色。
事实上，用结晶紫进行初染时所有的细菌都被染成紫色。
碘是一种媒染剂，能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，以增强染料与细菌的结合力。
只有经过酒精处理，再经复染，不同的细菌才会显现出不同的染色结果。
三、实验仪器、材料（一）显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯（或煤气灯）。
（二）石炭酸复红（品红）染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液1（三）菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、活性污泥等四、实验内容和步骤革兰氏染色步骤（图4）1．取大肠杆菌和枯草杆菌（均以无菌操作）分别做涂片、干燥、固定。
实验二细菌革兰氏染色ppt课件
五、思考题
1、讲述革兰氏染色的原理并指出E.C和B.S分别属于革兰 氏阳性或阴性？
2、观察细菌为什么要染色？为什么细菌染色多采用碱性 染料？
3、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色 成败的关键一步是什么？
crystal violet stain
wash with water
Counterstain wi在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱 色
时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足， 革
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等
Heat fixing
Staining
实验二 细菌革兰氏染色
一、实验目的
学习微生物制片、染色的基本技术 掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术 进一步观察细菌的基本形态
二、实验原理
C.Gram（革兰）于1884年 发明的一种鉴别不同类型 细菌的染色方法。
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
4、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色 技术和结果的正确性？
环境微生物：革兰氏染色
二、革兰氏染色原理
为什么通过革兰氏染色G+呈兰色，G-呈红色？
①脱色剂----95%乙醇为脂溶剂破坏G﹣的外膜、肽聚 糖层和 细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的 复合物从细胞中渗漏出来，当再用藩红复染时，显 现红色。
②但在G+细胞中，乙醇使厚的肽聚糖层脱水，导致孔 隙变小， 由于结晶紫和碘的复合物分子较大，不能 通过细胞壁，保持紫色。
革兰氏染色
革兰氏染色步骤 革兰氏染色原理
革兰氏染色
革兰氏染色—由丹麦科学家 Gram在1884年建立，是细菌学上最 重要的鉴别染色法。通过革兰氏染 色法可将细菌分成革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两大类。
革兰氏染色
1884年，丹麦医生C.Gram发明 程序： （1）初染（结晶紫1-2min） （2）媒染剂（碘液1min） （3）脱色（95%乙醇20~30S） （4）复染（蕃红1 ~ 2min） 结果判断：菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+）
球菌
肺炎链球菌
杆菌
炭疽杆菌
破伤风杆菌
肉毒芽孢杆菌
杆菌
变形杆菌
大肠杆菌
绿脓杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
感谢观看，欢 迎批评指正
菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-）
一、革兰氏染色步骤
3.媒染— 碘-碘化钾 溶液浸湿
1min
4. 脱色—95%乙醇溶液 进行颜色洗脱30s
5.复呈现第一次染色的效果紫色，
革兰氏阳性菌（紫阳G+）；
• 呈现第二次染色的效果红色；称
革兰氏阴性菌（红阴G -）
细菌革兰氏染色PPT课件
目录
• 引言 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的应用和限制 • 结论
01 引言
目的和背景
目的
介绍革兰氏染色的原理、方法及应用，帮助学习者更好地了解和掌握这一基本 染色技术。
背景
革兰氏染色是细菌学中最经典、最常用的染色方法之一，通过对细菌的染色， 可以将其分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，对于临床诊断和治疗具有 重要的指导意义。
结合其他技术
将革兰氏染色与其他技术如分子生 物学、免疫学等相结合，实现更精 确的细菌分类和鉴别。06Βιβλιοθήκη 结论总结革兰氏染色的重要性
临床诊断的关键工具
革兰氏染色是临床微生物实验室的基 本技术，用于快速识别细菌种类，对 准确诊断感染和选择合适的治疗方案 至关重要。
指导抗生素选择
科研的基础
在科研领域，革兰氏染色是研究细菌 种群结构、进化、生态和致病性的重 要手段。
染色
染色
用革兰氏染色液对固定后的涂片进行 染色，分别使用结晶紫、碘液和脱色 液进行初染、媒染和脱色处理。
染色注意事项
染色时应按照规定的步骤进行，避免 染色过度或不足，同时要确保染色液 的新鲜度和浓度适宜。
脱色
脱色
用脱色液对染色后的涂片进行脱色处理，以 去除菌体表面的结晶紫和碘液。
脱色注意事项
脱色时应控制脱色时间和脱色液的用量，避 免脱色过度或不足，影响染色效果。
革兰氏染色的工作原理
革兰氏染色利用了细菌细胞壁的成分 和结构对染料亲和性的差异，通过结 晶紫初染和碘液媒染后，由于细胞壁 组成成分对革兰氏染料的吸附能力不 同，酒精脱色时，细胞壁对染料的吸 附能力不同，从而导致被脱色的程度 不同，最终影响了复染后细菌的着色。
细菌的革兰氏染色实验报告
细菌的革兰氏染色实验报告细菌的革兰氏染色实验报告细菌是微生物界中最为常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气中等。
然而，由于细菌的微小体积和相似的形态特征，对于细菌的鉴定和分类一直是微生物学研究的难点之一。
革兰氏染色实验作为一种常用的细菌鉴定方法，被广泛应用于实验室和临床医学中。
革兰氏染色实验是由丹麦细菌学家克里斯蒂安·革兰于1884年首次提出的。
该实验通过染色剂的作用，将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两类。
在实验中，我们需要准备好革兰染色试剂盒，包括革兰碘液、革兰紫液、脱色剂和酒精等。
接下来，我们将详细介绍实验的步骤和观察结果。
首先，我们需要取一支无菌的玻璃杆，沾取待检测的细菌样品，将其涂抹在玻璃片上。
然后，将玻璃片放入火焰中进行固定，使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将固定的玻璃片浸入革兰碘液中，静置一段时间，使细菌吸收碘液。
在碘液作用后，将玻璃片取出，用脱色剂进行漂洗。
漂洗过程中，注意控制时间，以免过度漂洗导致革兰阳性菌染色不明显。
漂洗完成后，将玻璃片放入酒精中，进行脱色处理。
酒精的作用是去除革兰阴性菌的外膜，使其染色结果呈现出浅粉红色。
完成脱色后，将玻璃片取出，用水进行彻底冲洗，以去除残留的染色剂。
最后，将玻璃片放入革兰紫液中，静置片刻，使细菌染色。
革兰紫液的作用是使革兰阳性菌呈现出紫色，而革兰阴性菌则呈现出浅粉红色。
完成染色后，将玻璃片取出，用纸巾轻轻吸干水分。
然后，将玻璃片放在显微镜下观察。
在显微镜下，我们可以清晰地看到细菌的形态特征和染色结果。
革兰阳性菌呈现出紫色或暗紫色的颜色，而革兰阴性菌则呈现出浅粉红色。
通过观察染色结果，我们可以初步判断细菌的类型。
革兰阳性菌多为球形或椭圆形，细胞壁较厚，染色结果呈现出紫色。
而革兰阴性菌多为杆状或弯曲形，细胞壁较薄，染色结果呈现出浅粉红色。
然而，需要注意的是，革兰氏染色实验只能初步鉴定细菌的类型，对于某些特殊的细菌，可能需要进一步的鉴定方法。
细菌常用的染色方法
细菌常用的染色方法细菌是一类微生物，它们在自然界中广泛存在，包括空气、土壤、水体等各种环境中。
为了研究细菌的形态、结构和功能，科学家们发明了各种染色方法。
本文将介绍细菌常用的染色方法，包括革兰氏染色、抗酸染色和吉姆萨染色。
一、革兰氏染色革兰氏染色是最常用的细菌染色方法之一，它是根据细菌细胞壁的组成差异来区分细菌的。
革兰氏染色的步骤包括：将细菌涂片烘干，然后用碘酒浸泡，再用乙醇洗涤，最后用碱性颜料（如紫色染料）染色。
通过革兰氏染色，细菌可分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两类。
革兰阳性菌的细胞壁较厚，能保持紫色，而革兰阴性菌的细胞壁较薄，易被乙醇洗去紫色染料，然后再染红色。
革兰氏染色可以帮助科学家们快速区分细菌的类型，对于细菌的鉴定和分类具有重要意义。
二、抗酸染色抗酸染色是一种特殊的染色方法，用于检测结核菌和分枝杆菌等抗酸杆菌。
这些细菌具有特殊的脂质组分，使它们不易被一般染色方法染色。
抗酸染色的步骤包括：将细菌涂片加热，然后用碱性染料（如碱性红染料）染色，再用酸洗去多余染料，最后用蓝色染料（如甲基蓝）染色。
通过抗酸染色，结核菌和分枝杆菌等抗酸杆菌可呈现红色，而其他细菌则呈现蓝色。
这种染色方法对于抗酸杆菌的检测非常重要，可以帮助医生快速诊断结核病等疾病。
三、吉姆萨染色吉姆萨染色也是一种常用的细菌染色方法，它可以帮助科学家们观察细菌的形态和结构。
吉姆萨染色的步骤包括：将细菌涂片用吉姆萨染料（由蓝色和红色组成）染色，然后用水洗去多余染料，最后在显微镜下观察。
通过吉姆萨染色，细菌的细胞壁、细胞质等结构可以呈现出不同的颜色，帮助科学家们研究细菌的形态和结构特征。
吉姆萨染色在细菌学研究中应用广泛，对于揭示细菌的性状和特性非常重要。
细菌染色方法的研究和应用对于细菌学的发展和医学诊断具有重要意义。
除了上述介绍的革兰氏染色、抗酸染色和吉姆萨染色，还有许多其他的染色方法，如苏木精-伊红染色、格拉姆-玛尔基纳染色等。
这些方法都有各自的特点和适用范围，在细菌学研究和临床诊断中起到重要的作用。
微生物革兰氏染色法和芽孢染色法
芽孢染色法原理
用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下染色，使染料 不仅进入菌体，也可进入芽孢内。进入菌体的染 料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色后难以被水 洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保 留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色， 使芽孢和菌体易于区分。
细菌芽孢染色法
实验器材 1）菌种：枯草芽孢杆菌 2）染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番 红水溶液 3）器材：显微镜、滴管、酒精灯、载玻 片、接种环等
实验结果
营养细胞（红色） 芽孢（绿色）
结语
谢谢大家！
微生物革兰氏染色法和芽孢染色 法
革兰氏染色法
实验目的
学习并掌握革兰氏染色方法；了解革兰氏染 色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
实验原理
革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由 丹麦病理学家Hans Christian Gram 于1884年 创立。该法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色原理
显微镜滴管酒精灯载玻片接种环等细菌芽孢染色法一机医院检验科科内学习讲座实验步骤1改良的schaefferfulton氏染色法制备菌悬液孔雀绿染液2滴水浴加热染色1520min取1小滴涂片固水洗番红染液复染23min倾去染液水洗2schaefferfulton氏染色法涂片固定孔雀绿染液在微火上加热染色5min水洗番红染液复染2min细菌芽孢染色法一机医院检验科科内学习讲座芽孢绿色营养细胞红色一机医院检验科科内学习讲座
第一步：初染:结晶紫使菌体着上蓝紫色； 第二步：媒染:碘和结晶紫形成大分子复 合物，能被细胞壁阻留在细胞内；第三 步：酒精脱色:细胞壁成分和构造不同， 出现不同的反应——G+菌：细胞不能被 酒精脱色，仍呈紫蓝色；G-菌：酒精将 细胞脱色，细胞无色；第四步:番红复染， G-菌呈红色， G+菌呈紫蓝色。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
环境微生物学
第2章 原核生物 ——革兰氏染色
细菌的染色
由于细菌的细胞极其微小又十分透明，因此用水 浸片或悬滴观察法在光学显微镜下进行观察时， 只能看到大体形态和运动情况。若要在光学显微 镜下观察其形态和主要构造，一般都要对它们进 行染色。
2
细菌的染色
活菌：用美蓝或TTC(氯化三苯基四氮唑）等作活菌染色
4
2017/12/28
革兰氏染色机理
1.与细菌等电点有关
革兰氏阳性菌的等电点为pH2~3，革兰氏阴性菌的 等电点为pH4~5。革兰氏阳性菌的等电点比革兰氏 阴性菌低，说明革兰氏阳性菌带的负电荷比革兰氏 阴性菌多。它们与草酸铵结晶紫的结合力大，用碘碘化钾媒染后，两者的等电点均得到降低，但革兰 氏阳性菌的等电点降低的多，故与草酸铵结晶紫结 合得更牢固，对乙醇脱色的抵抗力更强。
而不被脱色，仍呈现紫色。
细菌细胞壁的生理功能
（1）保护原生质体免受渗透压引起破裂。 （2）维持细菌的细胞形态(可用溶菌酶处理不同形态的细菌细 胞壁后，菌体均呈现圆形得到证明)。 （3）细胞壁是多孔结构的分子筛，阻挡某些分子进入和保留蛋 白质在间质(革兰氏阴性菌细胞壁和细胞质之间的区域)。 （4）细胞壁为鞭毛提供支点，使鞭毛运动。
革兰阳性菌 较坚韧 20-80nm
可多达50层 占细胞壁干重40%-80%
+ 1-4% 约20%
-
革兰阴性菌 较疏松 10-15nm 1-2层
占细胞壁干重10% -
11-12% 约60%
+
G+ 与G— 细胞壁结构与化学成分的比较
1） 肽尾组成不同： 第三个氨基酸 G+ ：L—Lys,G—：m—DAP
③ 丙液 95%酒精溶液
④ 丁液（番红花红液） 2.5%番红花红酒精溶液 10毫升 蒸馏水 100毫升
1.涂片固定
3.媒染—碘-碘化钾溶液浸湿30S 4. 脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱
5.复染—红色的藩红染液第二次染色
革 兰 氏 染 色 法
2.初染—结晶紫染液第一次染色 1min
12
2
• 细菌呈现第一次染色的效 果紫色，革兰氏阳性菌（紫
2）交联度与交联方式不同 G+ 短肽都通过肽桥相连，交连四肽达到75%. G—并不是所有短肽都交联，短肽间没有肽桥，交联 四肽25%, 所以G+ 网状紧密，G—网状稀疏。
3） 细胞壁构造与组成不同 G+ 单层壁厚，90%肽聚糖，还有10%磷壁酸。 G—内外两层，内壁层肽聚糖10%，外壁层由脂多糖
，脂蛋白和磷脂构成。
Stage1 Staining with crystal violet.
Stage2 Stage3 Stage4
Fixation with iodine stabilizes crystal violet staining . All bacteria remain purple or blue. Extraction with alcohol. Decolorizes some bacteria (Gram negative) and not others (Gram positive). Counterstaining with safranin.
阳G＋）；
呈现第二次染色的效果红色； 称革兰氏阴性菌（红阴G -）
14
2017/12/28 ww
ww
15
误判与对照菌株
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色 过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色不够时，阴 性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长， 或已死亡及 部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
G-菌的细胞壁较薄，厚度为壁
外壁层分三层
中间层:磷脂 内层：脂蛋白
内壁层：肽聚糖
细菌细胞壁的结构图 A.革兰氏阳性菌的细胞壁 B.革兰氏阴性菌的细胞壁 C. 革兰氏阴性菌细胞壁的图解
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
细胞壁 强度 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 磷壁酸 脂肪 蛋白质 脂多糖
细菌染色法
死菌
简单染色法
正染色 鉴别染色法
负染色：荚膜染色法等
革兰氏染色法 抗酸性染色法 芽孢染色法 吉姆萨染色法
革兰氏染色原理
该染色法由丹麦医生C.Gram于1884年创立。
步骤
甲菌 乙菌
初染 结晶紫
媒染 碘液
脱色 乙醇
复染 沙黄
紫色(G+) 红色(G-)
1
2017/12/28
A single colony is placed on a slide and dried
Gram positive bacteria are stained with crystal violet and remain purple.
Gram negative bacteria are stained pink.
Staining: Dyes can be used to stain cells and increase their contrast-Gram Staining
同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片 ，作革兰氏染色对比。
枯草芽孢杆菌
蓝色（紫色） G+
大肠杆菌
红色
G-
3
2017/12/28
革兰氏染色的意义
通过这一染色，可把几乎所有的细菌分成革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两个大类。因此 是分类鉴定的重要指标。
这两类细菌在细胞结构、成分、形态、生理 、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等 方面都呈现出明显的差异，因此任何细菌只 要先通过很简单的革兰氏染色，即可提供不 少其他重要的生物学特性方面的信息。
细菌细胞结构
(一)细胞壁(cell wall) 细胞壁在细菌体表最外层的薄膜、坚韧有弹性的。占菌体
的10 %～25％。
细菌细胞
细胞壁 原生质体
细胞质膜(原生质膜) 细胞质及其内含物 细胞核物质
细菌细胞结构
(一)细胞壁(cell wall)
1. 细胞壁的化学组成与结构 G+菌的细胞壁厚，其厚度为20~80nm，含肽聚糖、磷壁酸 (质)、少量蛋白质和脂肪。
5
革兰氏试剂
用此液染色因先用甲液染色，再加乙液固定，用丙液处理，最 后用丁液复染。四种液体的配方如下：
① 甲液（结晶紫液） （1）结晶紫 2克 95%酒精 20毫升 （2）草酸铵 0.8克 蒸馏水 80毫升 使用前将（1）、（2）液相混，静置48小时后使用。
② 乙液(碘液) 碘 1克 碘化钾 2克 蒸馏水 300毫升 将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘，待碘全部溶解后， 加水稀释至300毫升。
细胞壁
① 革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌 ② 细胞壁的生理功能：
保护 维持形态 多孔分子筛 鞭毛支点
青霉素和溶菌酶的作用
The transpeptidation reaction that lead to the final cross-linking of two peptidoglycan chains Penicillin inhibits this reaction
2.与细胞壁有关
革兰氏阳性菌的脂类物质的含量很低，肽聚糖的含量 高。革兰氏阴性菌相反，用乙醇脱色时，革兰氏阴性 菌的脂类物质被乙醇溶解，增加细菌细胞壁的孔径及 其通透性，乙醇容易进入细胞内将草酸铵结晶紫和碘碘化钾复合物提取出来，使菌体呈现无色。革兰氏阳 性菌由于脂类物质含量极低，而肽聚糖含量高，乙醇 既是脱色剂又是脱水剂，使肽聚糖脱水缩小细胞壁的 孔径，降低细胞壁的通透性，阻止乙醇分子进入细胞 ，草酸铵结晶紫和碘-碘化钾的复合物被截留在细胞内