实验4 细菌革兰氏染色法

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【基本原理 基本原理】 基本原理
1. 油镜提高分辨率 油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间是隔一层油质. 油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间是隔一层油质. 如香柏油的折射率n=1.52,与玻璃相同. 如香柏油的折射率n=1.52,与玻璃相同. n=1.52 a)光线通过不减低视野的照明度; a)光线通过不减低视野的照明度; 光线通过不减低视野的照明度 b)更主要能增加数值孔径,提高显微镜的放大效能. b)更主要能增加数值孔径,提高显微镜的放大效能. 更主要能增加数值孔径 分辨率=λ/2NA 分辨率=λ/2NA λ=光波波 λ=光波波 α=镜口角的半数 α=镜口角的半数 (物镜的数值孔径值)NA=n×sinα 物镜的数值孔径值)NA=n× 用.
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【实验报告 实验报告】 实验报告
1. 结果 1)绘出油镜下观察的混合区菌体图像. 绘出油镜下观察的混合区菌体图像. 2)填表 表4-1 结果记录表 菌名 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 菌体颜色 细菌形态 结果( 结果(G+,G-)
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【注意事项 注意事项】 注意事项
★涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性;火焰固定不宜 涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性; 涂片不宜过厚 过热(以玻片不烫手为宜). 过热(以玻片不烫手为宜). ★加热时使用载玻片夹子及试管夹,以免烫伤. 加热时使用载玻片夹子及试管夹,以免烫伤. 加热时使用载玻片夹子及试管夹 ★使用染料时注意避免沾到衣物上. 使用染料时注意避免沾到衣物上. 使用染料时注意避免沾到衣物上 ★使用乙醇脱色时勿靠近火焰. 使用乙醇脱色时勿靠近火焰. 使用乙醇脱色时勿靠近火焰 ★实验后洗手. 实验后洗手. 实验后洗手
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【方法步骤 方法步骤】 方法步骤
涂片:将大肠杆菌(16h)和金黄色葡萄球菌(16h) 1. 涂片:将大肠杆菌(16h)和金黄色葡萄球菌(16h)分别 涂片,干燥,固定. 涂片,干燥,固定. 染色: 2. 染色: 1)初染:加草酸铵结晶紫一滴(以刚好将菌膜覆盖为宜), 初染:加草酸铵结晶紫一滴(以刚好将菌膜覆盖为宜), 染色1 2min后倾去染液 水洗至流出水无色; 后倾去染液, 染色1～2min后倾去染液,水洗至流出水无色; 2)媒染:先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min, 媒染:先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min, 1min 倾去碘液,水洗至流出水无色. 倾去碘液,水洗至流出水无色. 3)脱色:用滤纸吸去玻片上的残水(从边缘吸,以防擦去菌 脱色:用滤纸吸去玻片上的残水(从边缘吸, 体),将玻片倾斜,并衬以白背景,用95%乙醇滴洗至刚刚无紫 ),将玻片倾斜,并衬以白背景, 95%乙醇滴洗至刚刚无紫 将玻片倾斜 色为止, 30秒 立即用水冲去乙醇; 色为止,约20～30秒,立即用水冲去乙醇;
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【实验结果 实验结果】 实验结果
图4-2
大肠杆菌染色结果
图4-3 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合染色结果
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【实验用品 实验用品】 实验用品
菌种:大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物, 16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 1. 菌种:大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物,金黄色 葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物. 葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物. 16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 试剂:革兰氏染液,草酸铵结晶紫染液,卢戈氏(Lugol) 2. 试剂:革兰氏染液,草酸铵结晶紫染液,卢戈氏(Lugol) 碘液,95%乙醇,番红复染液等. 碘液,95%乙醇,番红复染液等. 乙醇 仪器和其他用品:酒精灯,载玻片,显微镜,双层瓶( 3. 仪器和其他用品:酒精灯,载玻片,显微镜,双层瓶(内装 香柏油和二甲苯),擦镜纸,接种环,试管架,镊子, 香柏油和二甲苯),擦镜纸,接种环,试管架,镊子,载玻 ),擦镜纸 片夹子,载玻片支架,滤纸,滴管和无菌生理盐水等. 片夹子,载玻片支架,滤纸,滴管和无菌生理盐水等.
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微生物学实验
实验四 油镜的使用及细菌革兰氏染色法
课前提问与目的要求 【课前提问 课前提问】 课前提问
1.油镜的特点及使用范围是什么? 1.油镜的特点及使用范围是什么? 油镜的特点及使用范围是什么 2.革兰氏染色的原理是什么? 2.革兰氏染色的原理是什么? 革兰氏染色的原理是什么
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生 物 学 实 验 教 学 中 心
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★可知n(介质折射率)对提高显微镜的分辩力起着关键性的作 可知n 介质折射率) 可知
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【基本原理 基本原理】 基本原理
2. 革兰氏染色 革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G+) 革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G+)和革兰氏阴性 (G-)两种类型,细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们 两种类型, 细胞壁的成分和结构不同而造成的. 细胞壁的成分和结构不同而造成的. 首先利用草酸铵结晶紫初染, 首先利用草酸铵结晶紫初染,所有细菌都会着上结晶紫的蓝 紫色.然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理, 紫色.然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理,由于碘与结晶 紫形成碘-结晶紫复合物,增强了染料在菌体中的滞留能力. 紫形成碘-结晶紫复合物,增强了染料在菌体中的滞留能力. 之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时, 之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时,两种细菌的脱色效果 95%乙醇作为脱色剂进行处理时 不同. 不同.
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【方法步骤 方法步骤】 方法步骤
★获得本实验成功的关键: 获得本实验成功的关键: 获得本实验成功的关键 1)选用活跃生长期菌种染色,老龄的革兰氏阳性细菌会被染 选用活跃生长期菌种染色, 成红色而造成假阴性. 成红色而造成假阴性. 2)涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性. 涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性. 3)脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够造成假阳性, 脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够造成假阳性, 脱色过度造成假阴性. 脱色过度造成假阴性.
【目的要求 目的要求】 目的要求
学习并掌握油镜的原理和使用方法; 1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法; 了解革兰氏染色原理; 2. 了解革兰氏染色原理; 学习并掌握革兰氏染色的方法. 3. 学习并掌握革兰氏染色的方法.
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图4-1 革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁比较
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【实验报告 实验报告】 实验报告
2. 思考题 1)革兰氏染色是否成功,有哪些问题需要注意,为什么? 革兰氏染色是否成功,有哪些问题需要注意,为什么? 2)现有一株未知杆菌,个体明显大于大肠杆菌,请你鉴定该 现有一株未知杆菌,个体明显大于大肠杆菌, 菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性, 菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性,如何确定你染色结果的正确 性? 3)为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性? 为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性? 4)你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略?在何种情况下 你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略? 可以省略? 可以省略?
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【基本原理 基本原理】 基本原理
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高,壁厚且脂质含量低, 革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高,壁厚且脂质含量低, 肽聚糖本身并不结合染料,但其所具有的网孔结构可以滞留碘肽聚糖本身并不结合染料,但其所具有的网孔结构可以滞留碘结晶紫复合物, 结晶紫复合物,现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩 而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁,菌体保持原有的蓝紫色. 而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁,菌体保持原有的蓝紫色. 而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低,交联度低, 而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低,交联度低,壁薄且 脂质含量高,乙醇处理时脂质溶解,细胞壁通透性增加, 脂质含量高,乙醇处理时脂质溶解,细胞壁通透性增加,原先 滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来, 滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来,菌体变为 无色,用复染剂(如番红)染色后又变为复染剂颜色( 无色,用复染剂(如番红)染色后又变为复染剂颜色(红).
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【方法步骤 方法步骤】 方法步骤
A. 初染 B. 水洗 C. 媒染 D. 水洗 E. 脱色 F. 水洗 G. 复染 H. 水洗 I. 吸干 图4-1 革兰氏染色程序
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【方法步骤 方法步骤】 方法步骤
4)复染:将玻片上残留水用吸水纸吸去,用番红复染液染色 复染:将玻片上残留水用吸水纸吸去, 2min,水洗,吸去残水晾干( 2min,水洗,吸去残水晾干(图4-1). 3.镜检:干燥后,油镜观察.以分散开的细菌颜色为准, 3.镜检:干燥后,油镜观察.以分散开的细菌颜色为准,革兰 镜检 氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色. 氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色. 4.混合制片观察:一载玻片上两种菌混合制片,对比观察. 4.混合制片观察:一载玻片上两种菌混合制片,对比观察.菌 混合制片观察 龄和脱色程度对染色结果影响较大. 龄和脱色程度对染色结果影响较大.