细菌的革兰氏染色法及形态观察

细菌的革兰氏染色法及形态观察

一、实验目的

1．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

2．学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。

二、基本原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色属于最重要的鉴别染色。一般认为革兰氏染色结果的主要原因是由于这两类细菌的细胞壁的结构和化学组成不同。革兰氏阳性菌细胞壁较厚（20-80nm)，主要成分为肽聚糖，网状结构紧密。而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄（2-3nm)，主要成分是脂蛋白和脂多糖。细菌经过初染和媒染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时细胞壁脱水，阳性细菌细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以至关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈蓝紫色。阴性菌脂类物质溶解，结晶紫－碘复合物随之被洗脱出，用复染剂复染后菌体呈复染后的红色。

三、实验器材

1．菌种大肠杆菌、藤黄八叠球菌约24小时营养琼脂斜面培养物。

2．仪器普通生物显微镜显微镜

3．材料载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、酒精灯、接种环等

4．染料草酸钱结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）碘液、95％乙醇、0.5 %番红染色液

四、实验流程

涂片→干燥→固定→初染1min→水洗→媒染1min→水洗→脱色10-30s→水洗→复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检。

五、操作步骤

1．涂片

取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径1cm 的均匀薄层，以淡淡的乳白色为宜。制片是染色的关键，载片要洁净，不得玷污油脂，菌体才能徐布均匀。注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。

2．干燥

涂布后，待其自然干燥或在酒精灯上方稍微加热，切勿靠近火焰。

3．固定

将已干燥好的涂片标本向上，在微火上以钟摆速度通过3-4次进行固定。固定的作用为：a.杀死细菌；b.使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；c.增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。

4．染色

a．初染在涂片处加草酸按结晶紫染色液（加量以盖满菌膜为度），染色1min。倾去染色液，用自来水细水小心地冲洗至洗出液为无色，水洗时水流不要直接冲洗涂面，以免水流过大将菌体冲掉。

b．媒染滴加（Lugol）碘液，染lmin，水洗。

c．脱色用滤纸吸去残水，滴加95％乙醇，轻轻摆动玻片脱色10-30s立即水洗，以终止脱色。

d．复染滴加番红，染色1min，水洗后晾干，也可以用吸水纸轻轻吸干。

e．镜检干燥后，置油镜下观察。被染成紫色者即为（G+)；被染成红色者是革兰氏阴性菌（G-）。

六、注意事项

1.涂片不宜过厚，否则宜脱色不完全造成假阳性。

2.火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞容易变形。

3.滴加染色液和酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。

4.乙醇脱色是关键，如脱色过度，则G+菌被误染成G-菌；脱色不足，G-菌被误染成G+菌。

5.染色要用处于活跃生长期的幼龄培养物，如菌龄过长，死亡或细胞壁受损的G+菌也会成阴性反应。

七、实验结果

根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。

八、混合方式的革兰氏染色（了解）

对于初学染色的同学，用于经验不足，特别是脱色掌握不好，往往容易将革兰氏阳性菌误认为革兰氏阴性菌，为了避免出现差错，可以将菌体与典型的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌混合后染色，再观察结果，就可以避免错误。在进行这个实验中，选用的用来混合的菌种应该在形态上与未知菌株有较大差异，而且实验者对选用的对照菌种的形态比较熟悉。

九、思考题

1. 为什么必须用培养24h以内的菌进行革兰氏染色？

2. 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键？为什么？