限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases）是一类酶，在一个特定的基因序列中，它能够以高精度地找到并且切割目标片段。
它的另一个叫法是限制性内切酶，是一种分子生物学中的重要工具，通常用来分离和分析特定的DNA片段，从而帮助研究人员全面了解和研究基因组。
这类酶被发现于1960年，并于1972年获得诺贝尔生理学或医学奖，因为它们在分子生物学方面具有重要的意义。
限制性核酸内切酶是一种能够将双链DNA分割成其他片段的酶。
它们是自然界中存在的，细菌通过限制内切酶来防御抗生素和其他有害细菌，另一方面，研究人员也可以使用它们来分离和分析DNA片段，从而了解基因信息和细胞运行机制。
在这种情况下，限制性核酸内切酶能够将双链DNA识别为其特定目标序列，在这个特定序列处将所有字母（A，T，G，C）切断，并将其分割成单链片段。
每个限制性核酸内切酶都有一个特定的识别序列，只有细菌有多种不同的内切酶，这些酶可以识别每个特定的目标序列，并且可以在这些序列处将双链DNA切割成片段。
限制性核酸内切酶的工作原理和精度使它们成为了分子生物学方面的重要工具。
它们可以用来识别和分析基因片段，而这些片段可以用来研究基因组，并了解基因如何影响细胞运作及机体发育，以及疾病随之而来的基因变化。
限制性核酸内切酶可以用来分离DNA，而这也是各种分子生物学应用所必需的。
例如，它们可以用来制作基因组图谱、分析基因组差异、复制特定基因以及在真核细胞和原核细胞等不同的生物体中测量基因表达的等，在医学研究中也有很大的应用。
此外，由于限制性核酸内切酶的超精确切割功能，它们被广泛应用于基因工程和转基因技术中，可以帮助开发者们分离和重组特定的基因，以获得想要的表型。
这些技术也能够应用于改变植物的物种，用以改善植物的各种性状，例如增加水合作用，减少营养价值，增强抗病性能，增加耐盐性以及改变其他特性。
总之，限制性核酸内切酶是一种重要的酶，它的工作原理和精确的切割功能使它成为了分子生物学研究中的重要工具，并且它还在基因工程和转基因技术中有着广泛的应用。
限制性核酸内切酶
生理意义
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护 机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受 到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中 可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但 并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对 DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶 切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化 DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切 割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感 性。另外，现在很多商业限制酶专门用于切割甲基化DNA。
E
Escherichia
(属)
co
coli
(种)
R
RY13
(品系)
I
的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限 制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type Ⅱ) 及第三型(Type Ⅲ)。
类型
第一型限制酶 同时具有修饰(modification)及识别切割(restriction)的作用;另有识别 (recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离 识别位(recognition site)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文 序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗 传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindⅢ。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，别离是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；还有认知(recognize)DNA 上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，有效性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性结尾”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处置不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性结尾, 能够彼此“粘合”,再经连接酶处置, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶要紧应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必需通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮忙才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用一样的限制酶处置, 使载体带上各类各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再挑选出所需的菌株, 便取得带有某一目的基因的繁衍系.用这种方式, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必需有较高的复制率, 以求取得大量的基因产物；必需具有一个选择性标志, 以便挑选；还要有一最多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求利用平安。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用
5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低
应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分） 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系
限制性内切酶
生技2班 张维嘉 楼辉辉 梁竟一 冯夏艳 孟慧 毛荣 殷智强
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点 或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制 酶分为三种类型，分别是第一型、第二型及第三型。 Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基 化的DNA的水解； Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解； III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基 序列分析；比较相关的DNA分子和遗传工程。 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力. 限制酶一般不切割自身的ype II restriction enzyme ） 识别序列： 5'GGGCC^C 3‘ BamHI（类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' C^TCGAG 3'
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程名词解释
名词解释【基因工程】：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物，植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
【限制性核酸内切酶】:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp）,并由此处切割DNA双链结构的核酸内切酶。
【识别序列】：限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。
【酶切位点】：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键点开的位置被称为切割位点。
【粘性末端】：是指含有几个核苷酸单链的末端，可通过这种末端的碱基互补，使不同的 DNA片段发生退火。
【平末端】：限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时产生的平齐的末端。
【同裂酶】：一些来源不同的但能识别位点的序列相同的限制性内切酶。
【同尾酶】：一些来源不同且识别序列不同，但能产生相同粘性末端的限制性内切酶。
【DNA的甲基化程度】:DNA被甲基化酶甲基化，识别序列中的核苷酸一旦被甲基化，就会影响内切酶的切割效率。
【位点偏爱】：对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象【内切酶的star活性】：某种限制性核酸内切酶在特定条件下，可在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为star活性。
【末端转移酶】：一种能将脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）加到某DNA片段上3’-OH基上的酶。
【DNA连接酶】：借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA双链,DNA片段紧靠在一起的3’-OH末端与5’-PO4末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接【DNA聚合酶】：以DNA为复制模板，使DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
【反转录酶】：与DNA聚合酶作用方式相似：5’→3’聚合，模版是mRNA,合成DNA【碱性磷酸酶】：能够催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA（或RNA)片段的5’-P 末端转换成5’-OH末端。
限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶
限制性核酸内切酶百科名片其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。
核酸内切酶核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。
从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。
如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。
一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。
[1]寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。
RNA聚合酶科技名词定义中文名称：RNA聚合酶英文名称：RNA polymerase定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。
所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases,RNases）是一类重要的核酸分子分析工具，是由胞壁杆菌和放线菌等微生物中编码的特定核酸酶类别。
它可以特异性的切割DNA和RNA的特定序列，对研究DNA和RNA的结构和功能有着重要的作用。
限制性核酸内切酶的分子结构基本上是由多聚腺苷酸（polypeptide）和双聚腺苷酸（dipeptide）组成的。
此外，它们还包含辅酶（cofactor），例如Mg2+或Ca2+、K+等，并且需要这些辅酶才能激活其具有酶活性。
一个限制性核酸内切酶在一次反应中可以检测出多个DNA序列，而且能够辨识具有同系特征特异性碱基对，尽量减少大量的氧化废物产生。
与其他核酸分子分析工具不同的是，限制性核酸内切酶具有单端可切或双端可切的特性，可以选择性地切割DNA分子的特定序列，其切割后的片段可以进一步用于分子生物学技术，如DNA测序、PCR及DNA杂交等。
例如，细菌DNA内切酶BamHI以TGT^AAT为切割位点，能有效地将DNA分子切断，切割后可以得到二条内切片段，分别以TGT和AAT为3端，以及一条5末端非切片段；而HpaII以C^CGG为切割位点，切割后可以得到二条内切片段，分别以C和CGG为5端，以及一条3末端的非切片段。
此外，限制性核酸内切酶还可用于检测DNA片段的克隆和定位，以及调控基因表达，控制蛋白质翻译等用途，因此，它们在遗传学、分子生物学研究中起着重要的作用。
它们能够解析特定DNA序列，同时保留它们的原始特征，有助于研究者对其进行详细的调查。
在生物技术的应用中，使用限制性核酸内切酶可以改变DNA序列，实现重组DNA的目的，创造各种抗性等目的。
因此，限制性核酸内切酶的重要性不言而喻。
它们是研究 DNARNA 构和功能的重要工具，同时也是实现技术转化的重要基础。
它们可以用于检测DNA片段，改变序列，以及调控基因表达等多种用途，同时也可以做出有意义的蛋白质和重要生物体系。
限制性核酸内切酶
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变 的菌株。
3. 温度
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割， 有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。
粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或 同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。
粘性末端和平齐末端的动画对比
四 限制性内切酶的识别序列
• EcoRⅠ的识别序列 GAATTC
•
CTTAAG
• Hind Ⅲ的识别序列 AAGCTT
•
TTCGAA
• BamHⅠ的识别序列 GCATCC
•
CCTAGG
• 从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出， 它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补 对称。
• 有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸 序列。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大 多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适 温度oC
酶
最适 温度oC
酶
Apa I 30 Apy I 30 Ban I Bcl I 50 BstE II 60 Mae I Mae II 50 Mae III 55 Sma I Taq I 65
最适 温度 oC
特性
限制和修饰活 性
内切酶的蛋白 结构
I类内切酶 单一多功能的酶 3种不同的亚基
限制性内切核酸酶名词解释
限制性内切核酸酶名词解释限制性内切核酸酶(restrictive endoribonuclease)能识别特异的核苷酸序列，它们不与单链的核酸共价结合，而是以共价键切开单链核酸，然后再将切开的片段两两链接起来形成完整的分子。
限制性内切核酸酶分为限制性激酶和限制性内切酶。
限制性内切核酸酶能有效降解RNA或DNA中的碱基、磷酸二酯键、侧链基团等核酸结构，从而阻止了DNA或RNA进入蛋白质或脂类等高分子化合物中，使其失去遗传功能或者发生改变。
它主要作用于核苷酸的3'-OH末端。
限制性内切核酸酶(restrictive endoribonuclease)分为限制性激酶和限制性内切酶。
限制性激酶仅对特定核苷酸序列敏感，而限制性内切酶则可识别并裂解特定核苷酸序列，并且有特异性。
限制性内切核酸酶能有效降解RNA或DNA中的碱基、磷酸二酯键、侧链基团等核酸结构，从而阻止了DNA或RNA进入蛋白质或脂类等高分子化合物中，使其失去遗传功能或者发生改变。
它主要作用于核苷酸的3'-OH末端。
这类酶通常比较稳定，多数不会自动水解底物，即使在无酶情况下也可保持活性。
由于它可被一些长寿命的蛋白质修饰，故认为限制性内切核酸酶具有超活性。
限制性内切核酸酶已经广泛应用于生物化学研究及临床诊断。
1、限制性内切核酸酶识别DNA或RNA的模板链的序列，并且限制性内切酶能够切割双链DNA分子； 2、限制性内切核酸酶与细胞内或细胞外的另一种酶——限制性核酸内切酶结合，对它进行识别和剪切； 3、当产生的酶与目标分子连接时，目标分子便能被释放出来，这就导致了基因表达的调控。
在基因工程中，将目标DNA的片段通过限制性内切酶切割之后，将两端的切口连接起来，这样就可以用连接酶将DNA片段连接起来，合成为双链DNA，进而实现DNA指导蛋白质的表达。
限制性内切核酸酶名词解释：是指能识别核苷酸序列并将其分解成小片段的内切核酸酶。
限制性内切核酸酶的识别序列是由3’端或5’端内含子组成的核苷酸序列。
限制性内切核酸酶
第三章限制性内切核酸酶一、填空题1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由——亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA片段。
作用时需要——作辅助因子，但不需要和6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：和7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_______ 分子量是300kDa.在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是，9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’-GRCGYG-3’，，其中R，Y12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和13.部分酶切可采取的措施有：(1)(2)(3)等。
限制性核酸内切酶一知识讲稿
切割方式独特
详细描述
Ⅲ型限制性核酸内切酶的切割方式也较为独特，它通常在识 别位点的两侧进行切割，产生具有不同序列和长度的DNA 片段。
总结词
应用潜力大
详细描述
由于Ⅲ型限制性核酸内切酶的独特特性和切割机制，它在 基因组学、生物信息学和基因治疗等领域具有较大的应用 潜力。
03
限制性核酸内切酶的作 用机制
04
限制性核酸内切酶的基 因工程应用
基因克隆与鉴定
基因克隆
限制性核酸内切酶能将DNA切割成特定序 列的片段，这一特性使得科学家能够通过切 割和重新连接DNA片段，将感兴趣的基因 从复杂的基因组中分离出来，从而实现基因 克隆。
基因鉴定
限制性核酸内切酶可以用来分析特定基因的 表达模式，通过比较不同组织或发育阶段中 特定基因的表达水平，可以了解该基因的功
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B型限制性核酸内切酶
总结词
切割位点固定
详细描述
B型限制性核酸内切酶的切割位点通常固定，切割后产生具有固定长度和序列的 粘性末端，这使得酶切后的DNA片段容易进行连接和重组。
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割效率高
详细描述
B型限制性核酸内切酶具有较高的切割效率，能够在短时间内将大量DNA分子进行切割，提高实验的 效率。
新技术的应用
随着生物技术的不断发展，限制性核酸内切酶的应用前景将更加 广阔，如基因编辑、基因治疗等领域。
安全性和伦理标准的提高
随着人们对生物技术的认识加深，限制性核酸内切酶的安全性和伦 理标准也将不断提高。
法规监管的完善
政府和国际组织将加强对限制性核酸内切酶的法规监管，确保技术 的合理应用和发展。
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限制性内切核酸酶名词解释
限制性内切核酸酶名词解释限制性内切核酸酶是一种能够识别并水解脱氧核苷酸侧链的蛋白质，是除磷酸双酯酶之外一类分子量比较大的酶。
这类酶不受其他限制性内切核酸酶或核酸酶的抑制，对许多蛋白质具有高度特异性。
大部分哺乳动物细胞都含有限制性内切核酸酶。
人的成熟红细胞、精子等也含有少量限制性内切核酸酶。
由于限制性内切核酸酶广泛存在于人体各组织细胞中，而且又可以对其进行高效降解，因此常被用于对细胞的活性研究。
现已知道人类有三种典型的限制性内切核酸酶：一种是位于13号染色体上的脊椎动物细胞核DNA限制性内切核酸酶;另一种是位于22号染色体上的鸟类细胞核DNA限制性内切核酸酶，以及一种位于X染色体上的人类细胞核和线粒体DNA限制性内切核酸酶。
最近，在哺乳动物细胞中发现了一种新的DNA限制性内切核酸酶。
限制性内切核酸酶对哺乳动物的DNA和RNA具有很高的专一性。
它们能识别被连接到碱基末端的核苷酸残基，并使脱氧核苷酸（或核糖核苷酸）沿着被切断的核苷酸末端彼此分开。
限制性内切核酸酶也叫做限制性核酸内切酶，是一类在某些条件下可以将DNA或RNA一分为二的特殊的核酸内切酶。
目前发现的限制性内切核酸酶包括3个亚家族，即头甲型限制性内切核酸酶、尾加型限制性内切核酸酶和未定型限制性内切核酸酶。
虽然还没有明确证据表明限制性内切核酸酶与人类癌症、基因突变、血型以及某些疾病的发生和发展有直接关系，但限制性内切核酸酶作为一类具有重要生理功能的酶，在基因工程技术的应用方面显示出巨大潜力。
与基因重组相比，基因修饰是限制性内切核酸酶作用的另一个重要领域。
因为基因修饰也是细胞中经常发生的事情。
限制性内切核酸酶的活性不仅取决于蛋白质的浓度，还取决于温度、 pH值、离子强度、金属离子、抑制剂、酶和DNA模板等多种因素，当这些因素发生变化时，限制性内切核酸酶的活性也会随之改变。
许多实验表明，不同温度和盐浓度对限制性内切核酸酶活性的影响是非常明显的，限制性内切核酸酶活性也随温度的升高而提高。
名词解释
三、名词解释：1.限制性核酸内切酶: 能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）2.遗传密码：mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码3.核酸的一级结构：核酸的一级结构是指组成核酸的核苷酸之间的连接方式及排列顺序。
4.增色效应：指与天然DNA相比，变性DNA因其双螺旋破坏，使碱基充分外露，因此紫外吸收增加，这种现象叫增色效应。
5.Tm 值：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（解链温度，Tm）。
6.核酸的变性：在理化因素作用下，核酸双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致核酸的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为核酸的变性。
7.核酶：具有自身催化作用的RNA称为核酶8.核酸分子杂交：两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。
四、简答题1 ．答：DNA 双螺旋结构模型的要点是：（ 1 ） DNA 是一反向平行的双链结构，脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧，碱基位于内侧，两条链的碱基之间以氢键相接触。
腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对存在，形成两个氢键（ A＝T ），鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对存在，形成三个氢键（G≡C ）。
碱基平面与线性分子结构的长轴相垂直。
一条链的走向是5'→3' ，另一条链的走向就一定是3'→5' 。
（2 ） DNA螺旋每旋转一周包含了 10 对碱基，每个碱基的旋转角度为36° 。
螺距为 3.4nm ，每个碱基平面之间的距离为 0.34nm 。
DNA 双螺旋分子存在一个大沟和一个小沟。
（3 ） DNA 双螺旋结构稳定的维系横向靠两条链间互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持。
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
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限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性末端”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物；必须具备一个选择性标志, 以便筛选；还要有一至多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求使用安全。
显然, 要寻找理想的天然载体是不容易的。
实际上, 基因工程中所采用的载体, 都是重新建造的。
2、在遗传分析方面要确定杂种子代中某部分DNA来源于哪一亲本, 用经典的遗传分析方法, 是相当困难的,若借助于限制酶, 则大为方便.3、在生物进化方面用限制酶处理后的DNA水解片段的电泳图谱进行比较的方法, 来分析生物的亲缘关系和进化, 特别是在近缘生物的分析中, 更具独特的优点.它既比DNA碱基顺序分析要简便,也比蛋白质氨基酸顺序的分析要直接, 更比染色体组型分析要精细.例子：EcoRI Escherichia coli5'GAATTC3'CTTAAG5'---G//AATTC---3'3'---CTTAA//G---5'BamHI Bacillus amyloliquefaciens5'GGATCC3'CCTAGG5'---G//GATCC---3'3'---CCTAG//G---5'限制性核酸内切酶 NotⅠ一、概念：NotⅠ是一种罕见的限制性内切酶，它可识别八个碱基的核酸序列( 5'-GC/GGCCGC-3') ，在低盐的情况下它还可识别( 5'-AC/GGCCGT-3')。
NotⅠ不仅为一普通的限制性内切酶，它在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力，有关NotⅠ蛋白性质特征及功能机制等方面的报道最近日渐增多。
二、应用：1.NotⅠ识别位点每65kb 的随机碱基序列中才出现一次，故可被用于基因组大片段的产生以及DNA 甲基化定位图谱的绘制。
2.因为其识别位点中富含G∶C序列，故其在真核生物基因组的GpC岛上出现频率较高（GpC岛通常位于基因转录起始区域，并且是DNA甲基化的热点区域）因此它可在很大程度上影响基因的表达。
NotⅠ对甲基化相当敏感，甲基化其识别位点的2或6位胞嘧啶上C5的任何一位都会阻止DNA被切割。
基于其低频率性和甲基化敏感性，NotⅠ通常可被用于在地标基因组扫描技术( Restriction Landmark Genomic Scanning，RLGS)中引进放射性标记物，这一技术已在肿瘤细胞中异常甲基化的研究中得到了广泛应用［3］。
3.在目前已被公认的各种限制性内切酶中，NotⅠ是唯一一个发现具有金属结构域的蛋白酶。
这一结构域由金属离子及四面体结构的Cys4模体构成的，位于靠近DNA识别位点的区域，在维持蛋白的组织结构上起一定作用。
这一研究结果表明NotⅠ有可能是随机性核酸内切酶( 其可识别更长的目的片段) 与限制性核酸内切酶的中间进化产物。
因此，为进行NotⅠ蛋白结构、性质及机理的进一步研究，其高表达菌株的构建及高纯度蛋白的大量获得显得极为重要。
三、研究现状：但目前商品化NotⅠ蛋白的价格依然居高不下，其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在，这一原因亦是造成许多其他广泛应用的限制性内切酶价格昂贵的主要因素。
现在NotⅠ纯化流程涉及到了磷酸纤维素阴离子交换柱、肝素琼脂糖亲和层析柱、DEAE-琼脂糖柱、PEI 柱四步上柱洗脱过程，最后再将NotⅠ在其存储缓冲液中透析过夜，整个纯化流程约需3 ～4d，工艺繁琐且蛋白损失相当严重。
为探索限制性内切酶的提纯新工艺，可通过分离和鉴定了NotⅠ基因后，及重组体的改建，对重组菌进行诱导条件摸索，获得了高表达工程菌。
应用KTA purifier 100蛋白纯化系统，对蛋白的纯化工艺进行创新优化，使提纯步骤大大简化，提纯时间缩减为原来的1/10，提高了得率、保证了酶活，从而使其在产量和效率上较以前报道均有很大程度提高，为实验室制备及工业化生产Ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。
且该酶的成功获得不仅在常规分子生物学实验中具有较高的应用价值，为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考，也为进一步研究NotⅠ限制性内切酶的结构及其特殊功能的研究奠定了良好的基础。
聚合酶聚合酶-分类可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。
前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。
DNA聚合酶只能在有引物的基础上，即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸，这DNA的合成方向记为5′→3′。
换言之DNA聚合酶催化反应除底物(αNTP)外，还需要Mg2+ 、模板DNA和引物，迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。
同样，上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA合成酶，它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物，并需有DNA模板以及Mn2 及Mg2 的存在下，在前一个核苷酸3′-OH与下一个核苷酸的5′-P聚合形成3′，5′-磷酸二酯键，其新生链的方向也是5′→3′。
聚合酶-特性聚合作用:在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。
3'5'外切酶活性──校对作用:这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸5'3'外切酶活性──切除修复作用:5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。
这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。
每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。
因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。
对冈崎片段5'末端DNA 引物的去除依赖此种外切酶活性。
RNA聚合酶的功能包括以下几个方面：（1）从DNA分子中识别转录的起始部位；（2）促使与酶结合的DNA双链分子打开；（3）催化适当的NTP以3'，5'-磷酸二酯键相连接，进行聚合反应，完成一条RNA转录本的合成；（4）识别DNA分子中的转录终止信号，促使聚合酶反应的停止；（5）参与转录水平的基因表达调控。
DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。
DNA聚合酶, 以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发具5－3外切酶活性），β（定位于核内，参与修复，具5－3外切酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，参与复制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，参与损伤修复，具有3－5和5－3外切活性）。
原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。
DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA 聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
双酶切双酶切：使用两种不同的限制性内切酶进行酶切产生两个不同的末端，从而使载体与目的基因的连接方向只存在一个，且可避免载体自连。
双酶切的操作：1.同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2.分步双酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。