抗体的制备及应用ppt
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主要步骤：
• • • • • 调节样品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),搅拌30分；。 室温高速离心(10000g，30分钟),收集上清液； 再加入硫酸铵（40%饱和度）； 4℃高速离心(10000g，15分钟) ,弃上清； 溶解沉淀，透析，测定浓度。
特点
• • •
•
成本较低，步骤较复杂。 抗体回收率很低。 抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种 标记。 需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。
取血测效价： 加强免疫两次或三次以后的第7天取血。 放血制备血清： 最后一次免疫后7-10天放血。 (在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段 时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存)
3) 如何免疫兔子
• • •
•
2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g） 基础免疫 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) 0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml） 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意
1
Ag
2 3
4
1 Ag
B1
4
3
B2 B3 B4 多克隆抗体
2
B3
B3
B3
B3
单克隆抗体
1、单克隆抗体的特点
特异性强，具有抗原结合位点的专一 性。（不是抗原的专一性！） 因结合位点的单一性，有时不易捕捉 抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。 抗体的性质相同，容易纯化、标记。
不要剪毛）
• • • •
•
加强免疫 间隔2-4周,可进行多次 0.5ml抗原(蛋白量减半) 0.5ml佛式不完全佐剂(IFA) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
• • •
•
免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法：1:104以上，能达到1:106。 免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64 效价达到要求的可放血制备血清 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
•
•
•
羊（sheep、goat）：常用于较大批量地 生产抗体（商品）。 马（horse）：常用于大批量生产治疗用 抗体（商品）。 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。
2）免疫的基本步骤
•
•
基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全 佐剂（Complate Freund’ adjuvand , 含矿物油,卡介苗等). 加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次， 间隔2-4周，用佛式不完全佐剂 (Incomplate Freund’ adjuvand , 不含卡介苗).
•
• • •
特点
• 成本较低，步骤较简单。 • 抗体回收率较高。 • 抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适 合于各种标记。 • 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 • 需要冷柜，自动收集器。
4、亲和层析法
•
原理
利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体） 将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配 的物质。 洗脱一般采用改变pH值的方法
• •
主要步骤
在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀； 4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀； 可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度: 0.313g/ml 45%饱和度: 0.277g/ml 40%饱和度: 0.243g/ml 最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析， 测定浓度。
•
特点
脑垂体分泌的一些激素：
hFSH 促卵泡激素 hLH 促黄体生成素
α β
α
β
hTSH 促甲状腺激素 hCG
α
β α β
#绒毛膜促性腺激素
单克隆抗体有交叉反应是由于不 同的抗原上有完全相同的表位（100% 的交叉反应）,或有相似的表位（不同 程度的交叉反应）。
产生凝集反应的原理
2 1
3 1 1
1
• • • •
成本低，步骤简单。 抗体的回收率比较高。 抗体纯度比较低，电泳后可见到明显 的杂带,不适合于做各种标记。 需要高速离心机。
2、正辛酸-硫酸铵沉淀法
原理 两步沉淀： • 先加正辛酸去杂蛋白. 正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下 (pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀. • 后加硫酸铵使抗体沉淀.
2 1 2
2
3 2
1
2 3
3
3 1
1
1
2 3
2 1
购买抗体时要注意厂商的标注
适合于做什么实验,使用浓度多少
• • • • • •
WB（Western blotting ，免疫印迹) IH (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) IC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) IEM (Immune lectron microscopy,免疫电镜) FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)
单抗与多抗的区别
抗体组成 抗体性质 纯化标记 种属来源 制备周期 制备技术 经费
单抗 单一 个体的属性 容易，效果好 绝大多数是小鼠 长 (最短4个月） 复杂 多
多抗 复杂 群体综合的性质 难度高一些 兔子、羊、豚鼠等 短（2个月） 简单 少
什么情况需要制备单抗
目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂
•
• • •
葡萄球菌A蛋白
•
•
• • •
(staphylococcal protein A,SPA) 金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白 分子量42000,等电点pH5.1 可与大多数动物Ig的Fc段结合 一个SPA分子有4个相似的活性部位 与IgG的结合最强,与IgM,IgA的结合较差
特点
2、多克隆抗体的特点
多抗是单抗的混合物，因此多抗的性 质是一个群体综合的性质。 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其 中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉 反应，所以多抗更容易有交叉反应。
比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。 抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时,血 清中含有的杂蛋白比较多.
抗体的制备及应用
一、抗体的一些基本概念
单克隆抗体 (Monoclonal Antibody,McAb) 单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体
多克隆抗体 (Polyclonal Antibody) 多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体
抗原（antigen ，Ag）
表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）
但能在体外长期生存）
阳性杂交瘤细胞 (hybridoma)
1 2 1 2
2 2 2
（既能分泌特异性抗体， 又能够在体外长期生存）
克隆化培养
（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）
生产单克隆抗体
2、多抗的制备
常用的免疫动物
免疫的基本步骤
如何免疫兔子
1）常用的免疫动物
•
•
•
兔子（rabbit）：最常用于自制抗体， 抗体量较多。（新西兰,大耳白） 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但 抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过 程要麻醉动物。（Wistar大鼠）
•
• •
带负电荷 的被吸附上
带负电荷少 的先被置换
带负电荷多 的后被置换
-
- -+ -
-
+
+ +
+
-
连续梯度洗脱:
NaCl Tris
梯度混合仪
阶段洗脱:
离子强度
倒入一定浓度的NaCl溶液
T
蛋白浓度
通过离心来分离
T
• •
主要步骤
先用硫酸铵沉淀抗体，粗提； 将样品过柱； 洗去没有结合的物质； 用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液； 紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。
三、抗体的纯化
盐析法（硫酸铵沉淀) 辛酸-硫酸铵沉淀法 离子交换法 亲和层析法 凝胶过滤法
1、盐析法（硫酸铵沉淀)
原理 • 在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中
的溶解度降低而产生沉淀 • 硫酸铵是最常用的中性盐 • 不同蛋白质的盐析常数不同 • 硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:767g/L)
•
•
主要步骤
•
• • •
将腹水或血清处理后上柱,样品要浓； (可用G-200，柱子要长，80-100cm) 待样品入柱后,用缓冲液过柱； 等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。 收集第一峰。
特点 • 成本高，步骤较简单。 • 抗体回收率较高，分离条件缓和，抗 体活性不受影响。 • 抗体纯度较高。 • 需要自动收集器。
二、抗体的制备
1、单克隆抗体的制备
无法采用生物化学的方法从多抗中分离 必须采用细胞杂交的方法来制备 能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问 题也有机遇问题
制备单克隆抗体的基本原理：
致敏的B淋巴细胞 （能够分泌特异性的抗体 ，
不能在体外长期生存 ）
骨髓瘤细胞 （myeloma） （不能分泌特异性的抗体，
•
•
使用前
样品结合(Binding)
洗脱(Elution)
• •
主要步骤
将Protein A与活化的柱子相结合(买商品柱)； 将腹水或血清处理后过柱； 用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零； 用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液； 测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。
3、离子交换法
•
原理
利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合 力的差异进行物质分离. DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基) 将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷. 采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子 (Cl-)置换被分离的组分.
• • • • • 成本高，步骤较简单。 抗体回收率低。 抗体纯度高，适合于各种标记。 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 需要自动收集器。
5、凝胶过滤法(分子筛)
•
原理
将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经 路径的差异,使不同分子质量的组分分离. 大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)
主要步骤：
• • • • • 调节样品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),搅拌30分；。 室温高速离心(10000g，30分钟),收集上清液； 再加入硫酸铵（40%饱和度）； 4℃高速离心(10000g，15分钟) ,弃上清； 溶解沉淀，透析，测定浓度。
特点
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成本较低，步骤较复杂。 抗体回收率很低。 抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种 标记。 需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。
取血测效价： 加强免疫两次或三次以后的第7天取血。 放血制备血清： 最后一次免疫后7-10天放血。 (在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段 时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存)
3) 如何免疫兔子
• • •
•
2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g） 基础免疫 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) 0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml） 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意
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Ag
2 3
4
1 Ag
B1
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B2 B3 B4 多克隆抗体
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B3
B3
B3
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单克隆抗体
1、单克隆抗体的特点
特异性强，具有抗原结合位点的专一 性。（不是抗原的专一性！） 因结合位点的单一性，有时不易捕捉 抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。 抗体的性质相同，容易纯化、标记。
不要剪毛）
• • • •
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加强免疫 间隔2-4周,可进行多次 0.5ml抗原(蛋白量减半) 0.5ml佛式不完全佐剂(IFA) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
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免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法：1:104以上，能达到1:106。 免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64 效价达到要求的可放血制备血清 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
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羊（sheep、goat）：常用于较大批量地 生产抗体（商品）。 马（horse）：常用于大批量生产治疗用 抗体（商品）。 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。
2）免疫的基本步骤
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•
基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全 佐剂（Complate Freund’ adjuvand , 含矿物油,卡介苗等). 加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次， 间隔2-4周，用佛式不完全佐剂 (Incomplate Freund’ adjuvand , 不含卡介苗).
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特点
• 成本较低，步骤较简单。 • 抗体回收率较高。 • 抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适 合于各种标记。 • 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 • 需要冷柜，自动收集器。
4、亲和层析法
•
原理
利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体） 将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配 的物质。 洗脱一般采用改变pH值的方法
• •
主要步骤
在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀； 4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀； 可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度: 0.313g/ml 45%饱和度: 0.277g/ml 40%饱和度: 0.243g/ml 最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析， 测定浓度。
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特点
脑垂体分泌的一些激素：
hFSH 促卵泡激素 hLH 促黄体生成素
α β
α
β
hTSH 促甲状腺激素 hCG
α
β α β
#绒毛膜促性腺激素
单克隆抗体有交叉反应是由于不 同的抗原上有完全相同的表位（100% 的交叉反应）,或有相似的表位（不同 程度的交叉反应）。
产生凝集反应的原理
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• • • •
成本低，步骤简单。 抗体的回收率比较高。 抗体纯度比较低，电泳后可见到明显 的杂带,不适合于做各种标记。 需要高速离心机。
2、正辛酸-硫酸铵沉淀法
原理 两步沉淀： • 先加正辛酸去杂蛋白. 正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下 (pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀. • 后加硫酸铵使抗体沉淀.
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购买抗体时要注意厂商的标注
适合于做什么实验,使用浓度多少
• • • • • •
WB（Western blotting ，免疫印迹) IH (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) IC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) IEM (Immune lectron microscopy,免疫电镜) FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)
单抗与多抗的区别
抗体组成 抗体性质 纯化标记 种属来源 制备周期 制备技术 经费
单抗 单一 个体的属性 容易，效果好 绝大多数是小鼠 长 (最短4个月） 复杂 多
多抗 复杂 群体综合的性质 难度高一些 兔子、羊、豚鼠等 短（2个月） 简单 少
什么情况需要制备单抗
目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂
•
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葡萄球菌A蛋白
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• • •
(staphylococcal protein A,SPA) 金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白 分子量42000,等电点pH5.1 可与大多数动物Ig的Fc段结合 一个SPA分子有4个相似的活性部位 与IgG的结合最强,与IgM,IgA的结合较差
特点
2、多克隆抗体的特点
多抗是单抗的混合物，因此多抗的性 质是一个群体综合的性质。 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其 中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉 反应，所以多抗更容易有交叉反应。
比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。 抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时,血 清中含有的杂蛋白比较多.
抗体的制备及应用
一、抗体的一些基本概念
单克隆抗体 (Monoclonal Antibody,McAb) 单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体
多克隆抗体 (Polyclonal Antibody) 多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体
抗原（antigen ，Ag）
表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）
但能在体外长期生存）
阳性杂交瘤细胞 (hybridoma)
1 2 1 2
2 2 2
（既能分泌特异性抗体， 又能够在体外长期生存）
克隆化培养
（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）
生产单克隆抗体
2、多抗的制备
常用的免疫动物
免疫的基本步骤
如何免疫兔子
1）常用的免疫动物
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兔子（rabbit）：最常用于自制抗体， 抗体量较多。（新西兰,大耳白） 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但 抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过 程要麻醉动物。（Wistar大鼠）
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带负电荷 的被吸附上
带负电荷少 的先被置换
带负电荷多 的后被置换
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- -+ -
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连续梯度洗脱:
NaCl Tris
梯度混合仪
阶段洗脱:
离子强度
倒入一定浓度的NaCl溶液
T
蛋白浓度
通过离心来分离
T
• •
主要步骤
先用硫酸铵沉淀抗体，粗提； 将样品过柱； 洗去没有结合的物质； 用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液； 紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。
三、抗体的纯化
盐析法（硫酸铵沉淀) 辛酸-硫酸铵沉淀法 离子交换法 亲和层析法 凝胶过滤法
1、盐析法（硫酸铵沉淀)
原理 • 在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中
的溶解度降低而产生沉淀 • 硫酸铵是最常用的中性盐 • 不同蛋白质的盐析常数不同 • 硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:767g/L)
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主要步骤
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将腹水或血清处理后上柱,样品要浓； (可用G-200，柱子要长，80-100cm) 待样品入柱后,用缓冲液过柱； 等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。 收集第一峰。
特点 • 成本高，步骤较简单。 • 抗体回收率较高，分离条件缓和，抗 体活性不受影响。 • 抗体纯度较高。 • 需要自动收集器。
二、抗体的制备
1、单克隆抗体的制备
无法采用生物化学的方法从多抗中分离 必须采用细胞杂交的方法来制备 能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问 题也有机遇问题
制备单克隆抗体的基本原理：
致敏的B淋巴细胞 （能够分泌特异性的抗体 ，
不能在体外长期生存 ）
骨髓瘤细胞 （myeloma） （不能分泌特异性的抗体，
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使用前
样品结合(Binding)
洗脱(Elution)
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主要步骤
将Protein A与活化的柱子相结合(买商品柱)； 将腹水或血清处理后过柱； 用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零； 用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液； 测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。
3、离子交换法
•
原理
利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合 力的差异进行物质分离. DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基) 将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷. 采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子 (Cl-)置换被分离的组分.
• • • • • 成本高，步骤较简单。 抗体回收率低。 抗体纯度高，适合于各种标记。 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 需要自动收集器。
5、凝胶过滤法(分子筛)
•
原理
将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经 路径的差异,使不同分子质量的组分分离. 大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)