几种海洋贝类基因组DNA的提取
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分别取 DNA 提取液 5μL 与 1μL 上样缓冲液混匀 ,上样于 0. 8 %的琼脂糖凝胶 ,用 1 ×TAE 电泳缓冲液 ,5v. cm - 1 电泳 30 min ,2 %溴化乙锭染色后 ,紫外灯下观察结果并拍照 。 2. 2. 2 紫外分光光度法检测 DNA 纯度和含量
取一定量的样品 DNA ,稀释 50 倍 ,用分光光度计分别测
(5) 蛋白的去除 :用常规的苯酚 、氯仿可有效除去蛋白杂 质 ,但 DNA 损失量很大 ,耗时长 。本人在采用前述快速提取的 方法时 ,将组织量加大些 ,用 1 克左右的组织 ,加入 5 微升 DNA 提取液 ,在 10 微升的离心管中反应 ,尝试不去除蛋白 ,直接用 2. 5 倍的无水乙醇沉淀 DNA ,有大量丝状的 DNA 析出并很快 聚集成一团 ,同时有絮状的蛋白析出 。用已剪去尖头的吸管 将 DNA 吸出 ,或用玻璃棒将其挑出 ,放入 1. 5 微升的离心管 中 ,用 80 %的乙醇洗涤三次 ,再用灭菌蒸馏水溶解 。经紫外分 光光度法检测 DNA 纯度 ,OD260ΠOD280 都达到了 1. 8 以上 ,说 明已有效去除蛋白质 ,并可用于 RAPD 扩增 ,两种方法提取的 DNA 的 RAPD 扩增结果有很好的重复性 。
本文探讨了用无水乙醇固定法保存的贝类样品和新鲜活体对 基因组 DNA 降解程度 、纯度的影响 ,及用常规 SDS 方法和快速 SDS 提取法获得的基因组 DNA 对 RAPD 的影响 。 1 材料与试剂 1. 1 主要仪器
仪 器
型 号
产 地
PCR 仪 数显恒温水浴锅 紫外分光光度计 台式高速离心机 稳压稳流电泳仪 凝胶成像系统仪
定 A260 、A280 的值 。根据 A260ΠA280 之比值判断 DNA 纯度 。根据 公式 : DNA 的含量 = A260 ×0. 05 ×稀释倍数 , 计算 DNA 浓 度 。[2 ] 2. 2. 3 RAPD 扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
用随机引物 S17 (碱基序列 :AGGGAACGAG) 对四种贝类进 行 RAPD 扩增 。反应混合液体积为 25μL ,其中含 RAPD 引物 S171μL (10pm) ,dNTPmix (10mmolΠL) 2μL ,10 ×Taq 酶 Buffer (不含 MgCl2) 2. 5μL ,MgCl2 2. 5μL ,模板 DNA2μL ,Taq 酶 0. 3μL ,无菌水 14. 7μL 。PCR 仪为 BIORAD 公司生产 。本实验 RAPD 反应条件 为 :94 ℃预变性 3min ,35 个扩增循环 (94 ℃45s ,39 ℃1min ,72 ℃ 1. 5min) ,72 ℃延伸 10min ,4 ℃保存 。[3] 3 结果与讨论 3. 1 实验结果 3. 1. 1DNA 琼脂糖凝胶电泳
(2) 快速 SDS 法提取基因组 DNA 上述常规提取方法虽 然得到的 DNA 纯度较高 ,但损失的 DNA 多 , 得率低 ,步骤繁 杂 ,耗时长 。在常规提取的基础上 ,本人通过改进实验步骤 , 加大样品量 ,省去加酚 、氯仿抽提除蛋白的步骤可快速大量地 提取基因组 DNA。即完成组织消化 ,除多糖 ,除 RNA 后 ,直接 加入 2. 5 倍体积的无水乙醇沉淀 DNA , 当丝状 DNA 析出后 , 用玻璃棒缠绕或用剪去尖头的枪头吸出 DNA ,放入 75 %乙醇 中洗 2 - 3 次 ,置于超净台内晾干 ,溶于灭菌双蒸水中 。 2. 2 DNA 完整度 、纯度的检测 2. 2. 1 琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 完整性
1. 青蛤 (1) 2. 青蛤 (2) 3. 缢坚 (3) 4. 缢时 (2) 5. 杂色蛤 (1) 6. 杂色蛤 (2) 7. 文蛤 (1) 8. 文蛤 (2) 9. 空白
图 1 四组 DNA 琼脂糖凝胶电泳 图 2 常规提取和快速提取基因组 DNA 的 RAPD 比较
技术的首要步骤 。模板 DNA 的完整性和纯度直接涉及到反应 体系模板对 RAPD 扩增结果的影响 。从本实验情况来看 ,所用 的常规提取方法和快速提取方法度都可以得到能用于 RAPD 分析的基因组 DNA。见图 2 。 3. 2 讨论
(1) 组织提取部位 :本人通过实验比较了从缢蛏不同组织 提取 DNA 的质量和浓度 ,认为从肌肉特别是闭合肌较易于提 取 DNA。
(3) DNA 的抽提方法 :无水乙醇固定的样本长时间保存后 有一定降解 ,如用离心沉淀法沉降 DNA 则将对 RAPD 等操作 产生影响 ,而用玻璃棒将 DNA 缠绕其上 ,再溶于水中 ,可得到 完整 DNA ,并可提高 RAPD 的重复性 。
(4) RNA 的除去 :用乙醇沉淀 DNA 时也将同时析出 ,RNA 对后续实验将产生影响 ,故在用乙醇沉淀 DNA 之前应先除去 RNA 。本人用 RN ase 酶法和 Li Cl 法除 RNA ,效果都很好 。
© 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
第 17 卷 第 4 期 胡虹 ,许雅娟 :几种海洋贝类基因组 DNA 的提取 · 2 9 ·
3. 1. 3 常规提取和快速提取基因组 DNA 的 RAPD 比较结果 从研究材料中制备纯的 、完整性好的 DNA 模板是 RAPD
(2) 组织保存方法 : 常用的固定剂有福尔马林 、乙醇等 。 西存友惠 (1999) 对 0dontesthes bonariensis 经福尔马林 、乙醇处 理的四种固定标本的 DNA 提取和 PCR 扩增进行了探讨 ,结果 表明酒精固定的标本最好 。刘宝忠等[4] 在研究海湾扇贝时 , 认为 70 %的乙醇固定海洋动物组织是提取 DNA 简便有效的 方法 。本人用 100 %乙醇固定贝类组织从中提取 DNA ,从保存 5 个月的标本中仍能提取出完整 、质量好的基因组 DNA ,但产 率较鲜 活 样 品 低 。进 行 RAPD ( 随 机 扩 增 DNA 多 态 性 分 析 Random Amplyfild Polymorphic DNA) 需要 DNA 的模板量非常少 , 但要求 DNA 质量要好 。随着保存时间的增长 , DNA 的降解 度增加 。
第 17 卷 第 4 期 2004 年 12 月
连云港职业技术学院学报 Journal of Lianyungang Technical College
V olD. e1c7.
No. 4 2004
文章编号 :1009 - 4318 (2004) 04 - 0027 - 03
几种海洋贝类基因组 DNA 的提取Ξ
胡 虹1 ,许雅娟2
(1. 连云港高等中医药技术学校 ,江苏 连云港 222006) (2. 连云港高等师范专科学校 ,江苏 连云港 222006)
摘 要 :海洋贝类中多糖和蛋白含量很高 ,不易获得高纯度 、完整的基因组 DNA ,且海洋贝类很易死亡腐败 ,将引起 DNA 的 降解 。而获得高纯度的完整 DNA 是进行 DNA 指纹图谱 、RAPD 分析和 DNA 测序等技术操作的前提 。SDS 方法可有效地去除多 糖 、蛋白 、RNA、酚等杂质 ,且可从无水乙醇固定的标本中提取高质量 DNA。
关键词 :贝类 ; 基因组 DNA ;提取 ;RAPD 中图分类号 :Q78 文献标识码 :A
0 导言 基因组 DNA 的提取是分子生物学的最基本操作之一 。获
得高质量的 DNA 是进行 DNA 指纹图谱 、RAPD 和 DNA 测序等 技术操作的前提 。海洋贝类很易死亡腐败 ,将引起 DNA 的降 解 ,因此可采用无水乙醇 、福尔马林的等固定标本的方法来保 存贝类样品 。其中无水乙醇固定法简单易行 ,保存效果好 。
四组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果见图 1 。从电泳图可看出 常规提取法和快速提取法都可以获得完整性很好的基因组 。 3. 1. 2 紫外分光光度法检测 DNA 纯度和含量
四组 DNA 用分光光度计分别测定 A260 、A280 的值 。结果见 表 1 。从表 1 可以看出 ,4 组 DNA 的 OD260ΠOD280 都达到了 1. 8 以上 ,说明用本文方法提取的 DNA 纯度较高 ,没有蛋白质污 染 。而且 ,4 组的 DNA 得率都较高 。
(1) 常规 SDS 法提取基因组 DNA 本人参照文献[1] 的 SDS 方法 ,并加以改进来提取贝类的基因组 DNA。几种样品分别 取其无水乙醇固定标本和鲜活体的闭合肌 200mg ,用蒸馏水洗 净 ,加入液氮研磨至干粉状 ,再加入已在 65°C 水浴中预热的 DNA 提取液 (25mmol·L - 1 Tris - HCI , PH8. 0 50mmol·L - 1 EDTA , 2 %SDS ,0. 2 %β- 巯基乙醇) 1mL 继续研磨 1 min ,转到 1. 5 mL 离心管 中 , 在 65°C 水 浴 中 加 热 40 min 后 , 8000r ·min - 1 离 心 5min ;取上清液 ,加入等体积的 5 mol·L - 1 KAC ,0°C 冰浴 30min 以除去多糖 ,8000r·min - 1 离心 5min ;取上清液 ,加入 8 mol·L - 1 LiCl ,沉淀 RNA ,8000r·min - 1 离心 5min ;取上清液 ,加入等体积 的苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25 :24 :1) 提取 10min ,6000r·min - 1 离心 15min ;取上清加入等体积的苯酚 :氯仿 :异戊醇 (25 :24 :1) 重复
A280
0. 039 0. 036 0. 031 0. 035 0. 046 0. 045 0. 044 0. 033
A260 / A280
1. 8 1. 8 1. 9 1. 8 1. 9 1. 8 1. 8 1. 8
DNA 的含量 (μg.μL - 1 ) 0. 178 0. 175 0. 145 0. 160 0. 223 0. 200 0. 203 0. 175
HH - 2 752 型光栅 GTL DY 602S
BIORAD 公司 常州国华仪器厂 上海精密科学仪器厂 南达生物技术开发公司
BIORAD 公司
1. 2 材料 取青蛤 、缢蛏 、杂色蛤 、文蛤等的Байду номын сангаас合肌 ,分别用取自新鲜
活体和用无水乙醇固定的样本 。 1. 3 试剂
Tris 、EDTA、SDS、RNaseA、β - 巯基乙醇 、碱性饱和酚 、氯 仿 、异戊醇 、无水乙醇 、异丙醇 、溴化乙锭等分析纯试剂 , Mark2 er (λEcoRIΠHind Ⅲ marker ) 、10 ×PCR buffer ( 不 含 Mg2 + ) 、 MgCl22μL 、TaqDNApolymerase (5. 0U/μL) 10mmol/ LdNTP 购 于 上 海生工生物工程技术服务有限公司 。琼脂糖 Agrose Ⅰ Spanish 分装 。 2 实验内容 2. 1 基因组 DNA 的提取
Ξ 收稿日期 :2004 - 05 - 16
© 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
· 28 · 连云港职业技术学院学报 2004 年 12 月
提取一次 ,离心除去蛋白质 ; 取上清液 ,加入等体积的氯仿 , 6000r·min - 1 离心 10 min 除去残留的苯酚 ;取上清液 ,加入 1Π10 体积的 3mol ·L - 1 醋酸钠和 2. 5 倍体积的 100 %乙醇 , - 20 ℃ 30min 沉 淀 DNA , 8000r ·min - 1 离 心 15min , 弃 上 清 液 , 沉 淀 用 75 %乙醇洗涤两次 ,置于超净台内晾干 ,溶于 40μL 灭菌去离子 水。
表 1 几种贝类的 A260 的值 、A260ΠA280 的比值及 DNA 的含量
样品
方法
青蛤
(1)
青蛤
(2)
缢蛏
(1)
缢蛏
(2)
杂色蛤
(1)
杂色蛤
(2)
文蛤
(1)
文蛤
(2)
注 : (1) 为常规提取 ; (2) 为快速提取
A260
0. 071 0. 070 0. 058 0. 064 0. 089 0. 080 0. 081 0. 070
取一定量的样品 DNA ,稀释 50 倍 ,用分光光度计分别测
(5) 蛋白的去除 :用常规的苯酚 、氯仿可有效除去蛋白杂 质 ,但 DNA 损失量很大 ,耗时长 。本人在采用前述快速提取的 方法时 ,将组织量加大些 ,用 1 克左右的组织 ,加入 5 微升 DNA 提取液 ,在 10 微升的离心管中反应 ,尝试不去除蛋白 ,直接用 2. 5 倍的无水乙醇沉淀 DNA ,有大量丝状的 DNA 析出并很快 聚集成一团 ,同时有絮状的蛋白析出 。用已剪去尖头的吸管 将 DNA 吸出 ,或用玻璃棒将其挑出 ,放入 1. 5 微升的离心管 中 ,用 80 %的乙醇洗涤三次 ,再用灭菌蒸馏水溶解 。经紫外分 光光度法检测 DNA 纯度 ,OD260ΠOD280 都达到了 1. 8 以上 ,说 明已有效去除蛋白质 ,并可用于 RAPD 扩增 ,两种方法提取的 DNA 的 RAPD 扩增结果有很好的重复性 。
本文探讨了用无水乙醇固定法保存的贝类样品和新鲜活体对 基因组 DNA 降解程度 、纯度的影响 ,及用常规 SDS 方法和快速 SDS 提取法获得的基因组 DNA 对 RAPD 的影响 。 1 材料与试剂 1. 1 主要仪器
仪 器
型 号
产 地
PCR 仪 数显恒温水浴锅 紫外分光光度计 台式高速离心机 稳压稳流电泳仪 凝胶成像系统仪
定 A260 、A280 的值 。根据 A260ΠA280 之比值判断 DNA 纯度 。根据 公式 : DNA 的含量 = A260 ×0. 05 ×稀释倍数 , 计算 DNA 浓 度 。[2 ] 2. 2. 3 RAPD 扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
用随机引物 S17 (碱基序列 :AGGGAACGAG) 对四种贝类进 行 RAPD 扩增 。反应混合液体积为 25μL ,其中含 RAPD 引物 S171μL (10pm) ,dNTPmix (10mmolΠL) 2μL ,10 ×Taq 酶 Buffer (不含 MgCl2) 2. 5μL ,MgCl2 2. 5μL ,模板 DNA2μL ,Taq 酶 0. 3μL ,无菌水 14. 7μL 。PCR 仪为 BIORAD 公司生产 。本实验 RAPD 反应条件 为 :94 ℃预变性 3min ,35 个扩增循环 (94 ℃45s ,39 ℃1min ,72 ℃ 1. 5min) ,72 ℃延伸 10min ,4 ℃保存 。[3] 3 结果与讨论 3. 1 实验结果 3. 1. 1DNA 琼脂糖凝胶电泳
(2) 快速 SDS 法提取基因组 DNA 上述常规提取方法虽 然得到的 DNA 纯度较高 ,但损失的 DNA 多 , 得率低 ,步骤繁 杂 ,耗时长 。在常规提取的基础上 ,本人通过改进实验步骤 , 加大样品量 ,省去加酚 、氯仿抽提除蛋白的步骤可快速大量地 提取基因组 DNA。即完成组织消化 ,除多糖 ,除 RNA 后 ,直接 加入 2. 5 倍体积的无水乙醇沉淀 DNA , 当丝状 DNA 析出后 , 用玻璃棒缠绕或用剪去尖头的枪头吸出 DNA ,放入 75 %乙醇 中洗 2 - 3 次 ,置于超净台内晾干 ,溶于灭菌双蒸水中 。 2. 2 DNA 完整度 、纯度的检测 2. 2. 1 琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 完整性
1. 青蛤 (1) 2. 青蛤 (2) 3. 缢坚 (3) 4. 缢时 (2) 5. 杂色蛤 (1) 6. 杂色蛤 (2) 7. 文蛤 (1) 8. 文蛤 (2) 9. 空白
图 1 四组 DNA 琼脂糖凝胶电泳 图 2 常规提取和快速提取基因组 DNA 的 RAPD 比较
技术的首要步骤 。模板 DNA 的完整性和纯度直接涉及到反应 体系模板对 RAPD 扩增结果的影响 。从本实验情况来看 ,所用 的常规提取方法和快速提取方法度都可以得到能用于 RAPD 分析的基因组 DNA。见图 2 。 3. 2 讨论
(1) 组织提取部位 :本人通过实验比较了从缢蛏不同组织 提取 DNA 的质量和浓度 ,认为从肌肉特别是闭合肌较易于提 取 DNA。
(3) DNA 的抽提方法 :无水乙醇固定的样本长时间保存后 有一定降解 ,如用离心沉淀法沉降 DNA 则将对 RAPD 等操作 产生影响 ,而用玻璃棒将 DNA 缠绕其上 ,再溶于水中 ,可得到 完整 DNA ,并可提高 RAPD 的重复性 。
(4) RNA 的除去 :用乙醇沉淀 DNA 时也将同时析出 ,RNA 对后续实验将产生影响 ,故在用乙醇沉淀 DNA 之前应先除去 RNA 。本人用 RN ase 酶法和 Li Cl 法除 RNA ,效果都很好 。
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3. 1. 3 常规提取和快速提取基因组 DNA 的 RAPD 比较结果 从研究材料中制备纯的 、完整性好的 DNA 模板是 RAPD
(2) 组织保存方法 : 常用的固定剂有福尔马林 、乙醇等 。 西存友惠 (1999) 对 0dontesthes bonariensis 经福尔马林 、乙醇处 理的四种固定标本的 DNA 提取和 PCR 扩增进行了探讨 ,结果 表明酒精固定的标本最好 。刘宝忠等[4] 在研究海湾扇贝时 , 认为 70 %的乙醇固定海洋动物组织是提取 DNA 简便有效的 方法 。本人用 100 %乙醇固定贝类组织从中提取 DNA ,从保存 5 个月的标本中仍能提取出完整 、质量好的基因组 DNA ,但产 率较鲜 活 样 品 低 。进 行 RAPD ( 随 机 扩 增 DNA 多 态 性 分 析 Random Amplyfild Polymorphic DNA) 需要 DNA 的模板量非常少 , 但要求 DNA 质量要好 。随着保存时间的增长 , DNA 的降解 度增加 。
第 17 卷 第 4 期 2004 年 12 月
连云港职业技术学院学报 Journal of Lianyungang Technical College
V olD. e1c7.
No. 4 2004
文章编号 :1009 - 4318 (2004) 04 - 0027 - 03
几种海洋贝类基因组 DNA 的提取Ξ
胡 虹1 ,许雅娟2
(1. 连云港高等中医药技术学校 ,江苏 连云港 222006) (2. 连云港高等师范专科学校 ,江苏 连云港 222006)
摘 要 :海洋贝类中多糖和蛋白含量很高 ,不易获得高纯度 、完整的基因组 DNA ,且海洋贝类很易死亡腐败 ,将引起 DNA 的 降解 。而获得高纯度的完整 DNA 是进行 DNA 指纹图谱 、RAPD 分析和 DNA 测序等技术操作的前提 。SDS 方法可有效地去除多 糖 、蛋白 、RNA、酚等杂质 ,且可从无水乙醇固定的标本中提取高质量 DNA。
关键词 :贝类 ; 基因组 DNA ;提取 ;RAPD 中图分类号 :Q78 文献标识码 :A
0 导言 基因组 DNA 的提取是分子生物学的最基本操作之一 。获
得高质量的 DNA 是进行 DNA 指纹图谱 、RAPD 和 DNA 测序等 技术操作的前提 。海洋贝类很易死亡腐败 ,将引起 DNA 的降 解 ,因此可采用无水乙醇 、福尔马林的等固定标本的方法来保 存贝类样品 。其中无水乙醇固定法简单易行 ,保存效果好 。
四组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果见图 1 。从电泳图可看出 常规提取法和快速提取法都可以获得完整性很好的基因组 。 3. 1. 2 紫外分光光度法检测 DNA 纯度和含量
四组 DNA 用分光光度计分别测定 A260 、A280 的值 。结果见 表 1 。从表 1 可以看出 ,4 组 DNA 的 OD260ΠOD280 都达到了 1. 8 以上 ,说明用本文方法提取的 DNA 纯度较高 ,没有蛋白质污 染 。而且 ,4 组的 DNA 得率都较高 。
(1) 常规 SDS 法提取基因组 DNA 本人参照文献[1] 的 SDS 方法 ,并加以改进来提取贝类的基因组 DNA。几种样品分别 取其无水乙醇固定标本和鲜活体的闭合肌 200mg ,用蒸馏水洗 净 ,加入液氮研磨至干粉状 ,再加入已在 65°C 水浴中预热的 DNA 提取液 (25mmol·L - 1 Tris - HCI , PH8. 0 50mmol·L - 1 EDTA , 2 %SDS ,0. 2 %β- 巯基乙醇) 1mL 继续研磨 1 min ,转到 1. 5 mL 离心管 中 , 在 65°C 水 浴 中 加 热 40 min 后 , 8000r ·min - 1 离 心 5min ;取上清液 ,加入等体积的 5 mol·L - 1 KAC ,0°C 冰浴 30min 以除去多糖 ,8000r·min - 1 离心 5min ;取上清液 ,加入 8 mol·L - 1 LiCl ,沉淀 RNA ,8000r·min - 1 离心 5min ;取上清液 ,加入等体积 的苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25 :24 :1) 提取 10min ,6000r·min - 1 离心 15min ;取上清加入等体积的苯酚 :氯仿 :异戊醇 (25 :24 :1) 重复
A280
0. 039 0. 036 0. 031 0. 035 0. 046 0. 045 0. 044 0. 033
A260 / A280
1. 8 1. 8 1. 9 1. 8 1. 9 1. 8 1. 8 1. 8
DNA 的含量 (μg.μL - 1 ) 0. 178 0. 175 0. 145 0. 160 0. 223 0. 200 0. 203 0. 175
HH - 2 752 型光栅 GTL DY 602S
BIORAD 公司 常州国华仪器厂 上海精密科学仪器厂 南达生物技术开发公司
BIORAD 公司
1. 2 材料 取青蛤 、缢蛏 、杂色蛤 、文蛤等的Байду номын сангаас合肌 ,分别用取自新鲜
活体和用无水乙醇固定的样本 。 1. 3 试剂
Tris 、EDTA、SDS、RNaseA、β - 巯基乙醇 、碱性饱和酚 、氯 仿 、异戊醇 、无水乙醇 、异丙醇 、溴化乙锭等分析纯试剂 , Mark2 er (λEcoRIΠHind Ⅲ marker ) 、10 ×PCR buffer ( 不 含 Mg2 + ) 、 MgCl22μL 、TaqDNApolymerase (5. 0U/μL) 10mmol/ LdNTP 购 于 上 海生工生物工程技术服务有限公司 。琼脂糖 Agrose Ⅰ Spanish 分装 。 2 实验内容 2. 1 基因组 DNA 的提取
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提取一次 ,离心除去蛋白质 ; 取上清液 ,加入等体积的氯仿 , 6000r·min - 1 离心 10 min 除去残留的苯酚 ;取上清液 ,加入 1Π10 体积的 3mol ·L - 1 醋酸钠和 2. 5 倍体积的 100 %乙醇 , - 20 ℃ 30min 沉 淀 DNA , 8000r ·min - 1 离 心 15min , 弃 上 清 液 , 沉 淀 用 75 %乙醇洗涤两次 ,置于超净台内晾干 ,溶于 40μL 灭菌去离子 水。
表 1 几种贝类的 A260 的值 、A260ΠA280 的比值及 DNA 的含量
样品
方法
青蛤
(1)
青蛤
(2)
缢蛏
(1)
缢蛏
(2)
杂色蛤
(1)
杂色蛤
(2)
文蛤
(1)
文蛤
(2)
注 : (1) 为常规提取 ; (2) 为快速提取
A260
0. 071 0. 070 0. 058 0. 064 0. 089 0. 080 0. 081 0. 070